AbMole精研抑制剂十年，最新的科研动态不断与您分享。本期与您分享的是:中性粒细胞驱动的CD206hiMHCIIlo巨噬细胞是系统性硬化症中皮肤纤维化的关键。
系统性硬化症（SSc）是一种顽固性的自身免疫性疾病，其特征是在皮肤和内部器官，如肺的进行性发热。这种疾病的一个关键特征是先天免疫细胞的形成，然而，它们如何促进SSc的发病机制在很大程度上是未知的。在这里，我们证明了CD206hiMHCIIlo巨噬细胞是SSc小鼠皮肤纤维中积累的主要免疫细胞群，发现这些细胞在以MerTK信号依赖的方式产生TGF-β1来调节纤维化反应中至关重要。有趣的是，中性粒细胞的扩张是CD206hiMHCIIlo巨噬细胞积累的先决条件，消耗中性粒细胞或抑制CXCR1/2可以减少CD206hiMHCIIlo巨噬细胞，缓解SSc的进展。详细的研究显示，在纤维化皮肤中，中性粒细胞释放中性粒细胞胞外陷阱（NETs）诱捕的巨噬细胞，并负责CD206hiMHCIIlo巨噬细胞的分化。我们的研究结果揭示了中性粒细胞-巨噬细胞-纤维化轴在SSc发病机制中的关键作用，并提供了关键作用。
Bleomycin sulfate (BLM)(Abmole，M2100，纯度为1.5~2.0U/mg, BR)是一种糖肽类抗生素，作用于鳞状细胞癌，是一种抗癌剂，作用于UT-SCC-19A细胞，IC50为4 nM。
Figure 1. Macrophages are key contributors to skin fibrosis during SSc.
通过CD64的免疫荧光染色检测了皮损中巨噬细胞的分布，发现注入的CD64+细胞主要聚集在BLM处理小鼠的真皮中（图1A）。为了确定巨噬细胞的前溴化作用，用氯膦酸脂质体（Clo）消耗它们。在BLM治疗前第3天开始腹腔注射Clo或对照脂质体（Ctrl），并在整个SSc诱导过程中每4天重复一次（图1B）。H&E染色（图1D）和Sirius红染色（图1E）显示，Clo有效消融小鼠皮肤巨噬细胞（图1C），Sirius红染色减弱皮肤厚度和胶原沉积的增加。α-SMA染色是纤维化的一个标志，也显示了Clo治疗后皮肤纤维化的障碍（图1F）。这些结果清楚地表明，巨噬细胞是SSc期间皮肤骨质疏松发展的关键贡献者。
Figure 2. CD206hiMHCIIlomacrophages promote SSc skin fi brosis via MerTK signaling.
为了确定巨噬细胞在BLM诱导的SSc皮肤损伤中的表型相关功能，通过流式细胞术分析了皮肤巨噬细胞的标记物，以确定其相关亚群。皮肤巨噬细胞（CD11b+CD64+）根据CD64和Ly6C的表达情况分为两个群体（图2A，左）。CD64+Ly6C+群体具有巨噬细胞（CD64+）和单核细胞（Ly6C+）的混合标记物，可以认为是成熟的巨噬细胞，代表从单核细胞到巨噬细胞的过渡状态，而CD64+Ly6C-群体被认为是成熟的巨噬细胞。根据CD206（主要在抗炎症巨噬细胞上表达）和MHCII（主要在前炎症巨噬细胞上表达）的表达，这2个巨噬细胞群体可进一步分为不同的亚群。因此，在对照组小鼠中观察到2组CD64+Ly6C+成熟巨噬细胞、CD206-MHCII-和CD206loMHCIIhi（图2A），以及4组CD64+Ly6C成熟巨噬细胞、CD206-MHCII-、CD206loMHCIIhi、CD206hiMHCIIIhi和CD206hiMHCIIlo（图2B）。CD64+Ly6C+成熟的巨噬细胞亚群在BLM刺激后没有明显变化（图2A）。相比之下，CD64+ly6c成熟巨噬细胞亚群显著改变。一方面，CD206hiMHCIIhi子集几乎消失。另一方面，CD206hiMHCIIlo亚群显著增加（图2B）。需要强调的是，根据CD206的高表达和MHCII的低表达，CD206hiMHCIIlo巨噬细胞与所谓的M2巨噬细胞类似。因此，检测了M2巨噬细胞的标记物Arg-1在CD64+ly6c成熟巨噬细胞的4个亚群中的表达。在BLM处理后，4个亚群中Arg-1阳性细胞均显著增加，但CD206hiMHCIIlo亚群中增加最为明显（图2C），CD64+Ly6C成熟巨噬细胞中主要的Arg-1+细胞（图2D）。
在组织稳态维持期间，抗炎症性M2样巨噬细胞具有强大的吞噬能力，通过TAM受体（Tyro3、Axl和MerTK）清除死亡细胞和碎片。然而，TAM受体的过度激活也与组织纤维化有关。MerTK的激活已被证明可以促进TGF-β1的产生。因此，我们推测CD206hiMHCIIlo巨噬细胞可能通过持续参与吞噬作用来促进皮肤的凝固。与预期的一样，在BLM处理的小鼠中，CD64+ly6c成熟巨噬细胞的所有4个亚群中，关键的吞噬受体MerTK均显著上调（图2E）。另一方面，CD64+Ly6C+成熟的巨噬细胞表达较少的MerTK。在CD64+Ly6C-细胞中，CD206hiMHCIIlo巨噬细胞中MerTK的表达量最高（图2F）。有趣的是，MerTK的配体Gas6在BLM处理小鼠的皮肤裂解液中显著增加（图2G），进一步表明MerTK在SSc皮肤损伤中的作用。
为了确定CD206hiMHCIIlo巨噬细胞中MerTK信号通路的上调是否有助于其前溴化能力，我们用MerTK抑制剂UNC2250对BLM刺激小鼠进行腹腔注射。从整个SSc诱导过程中，从第0天开始每天进行治疗（图2H）。与DMSO处理组相比，H&E染色（图2I）和Sirius红染色（图2J）显示，UNC2250处理组的皮肤厚度和胶原蛋白含量显著降低。α-SMA染色也证实了UNC2250处理组中纤维化的衰减（图2K）。据报道，MerTK的激活可导致巨噬细胞表现出抗炎症的M2样表型。因此，我们确定了MerTK是否介导CD206hiMHCIIlo巨噬细胞的极化。UNC2250处理不影响CD206hiMHCIIlo巨噬细胞的丰度（图2L）。然而，研究发现MerTK与TGF-β1高度共定位（图2M），而UNC2250处理显著降低了CD206hiMHCIIlo巨噬细胞中TGF-β1的表达（图2N）。基于这些结果，我们得出结论，MerTK信号通路的上调是错误的。
Figure 3. Neutrophil depletion inhibits the differentiation of CD206hiMHCIIlomacrophages.
早在BLM治疗后2小时，中性粒细胞就在皮肤病变中积累，随后立即出现巨噬细胞（图3A）。中性粒细胞和巨噬细胞在SSc诱导的前3天都以很高的速率膨胀，代表了早期的炎症阶段。纤维化从第2周到第4周开始，在此期间，中性粒细胞持续存在，尽管发生的频率相对较低。另一方面，巨噬细胞的密度仍然较高。这一动力学表明，在SSc进展过程中，中性粒细胞可能与巨噬细胞协同作用。事实上，已经证明，在肺和心脏组织损伤过程中，中性粒细胞通过分泌因子或通过“气泡细胞作用”过程将巨噬细胞重新编程为M2样表型。因此，我们研究了中性粒细胞对SSc期间巨噬细胞分化或招募的影响。我们用抗Ly6G抗体去除中性粒细胞（图3B）。为了检验中性粒细胞在炎症期对巨噬细胞的作用，腹腔注射抗Ly6G：一个从第3天开始，每4天，另一个从第10天开始，每4天（图3C）。在两种实验方案中，中性粒细胞消耗导致CD206hiMHCIIlo巨噬细胞显著减少，表明中性粒细胞对CD206hiMHCIIlo巨噬细胞的分化至关重要（图3D）。然而，中性粒细胞消耗对总巨噬细胞的百分比没有影响（图3E，左）。进一步分析显示，CD64+Ly6C+成熟巨噬细胞和CD64+Ly6C成熟巨噬细胞均未受到中性粒细胞消耗的影响（图3E，中、右）。重要的是，中性粒细胞消耗减弱了皮肤纤维化，如皮肤厚度（图3F）和胶原沉积（图3G）。在中性粒细胞消耗时，α-SMA的表达也显著降低（图3H）。这些结果表明，中性粒细胞消耗抑制了纤维化促进CD206hiMHCIIlo巨噬细胞的分化。
Figure 4. Inhibition of CXCR1/2 reduced CD206hiMHCIIlomacrophages.
趋化剂-趋化因子受体轴负责中性粒细胞的募集。CXCR1和CXCR2是中性粒细胞上表达的主要趋化因子受体，这些受体可被ELR阳性的CXC趋化因子激活，包括CXCL1、2、3和CXCL5、6、7和8。这些趋化因子不仅介导中性粒细胞向指定部位的迁移，而且还促进骨髓中中性粒细胞的释放。为了进一步阐明被招募的中性粒细胞在促进CD206hiMHCIIlo巨噬细胞极化中的作用，我们还检测了CXCR1/2抑制剂Reparixin的作用。从整个SSc诱导过程中，从第0天开始，每天给BLM治疗或未治疗的小鼠腹腔注射Reparixin或DMSO（图4A）。Reparixin不仅强烈抑制了中性粒细胞进入皮肤的扩张（图4B），而且还减少了脾脏中的中性粒细胞（图4C）。Reparixin抑制CXCR1/2也能显著降低CD206hiMHCIIlo巨噬细胞的百分比（图4D）。瑞帕利素治疗诱导的中性粒细胞减少并不影响总巨噬细胞数量的百分比（图4E，左）。通过H&E染色（图4F）、Sirius红染色（图4G）和α-SMA免疫荧光染色（图4H），利帕素处理组的皮肤厚度、胶原含量和α-SMA表达均明显降低。这些结果清楚地表明，cxcr1/2介导的中性粒细胞招募对于CD206hiMHCIIlo巨噬细胞介导的皮肤纤维化至关重要。
Figure 5. Neutrophil released NETs promote the differentiation of CD206hiMHCIIlomacrophages.
通过免疫荧光染色分析（图5A）显示，在BLM处理小鼠的皮肤中，瓜氨酸化组蛋白3（cit-H3）显著增加。为了直接检测NETs的作用，我们在体外通过PMA和LPS处理诱导骨髓源性中性粒细胞中的NETs，并将其与骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）共培养24h（图5C）。在体内实验中发现了在CD206hiMHCIIlo巨噬细胞上高表达的MerTK、Arg-1和CD206的表达水平。有趣的是，单独的NETs增加了MerTK的表达（图5D），但并没有改变巨噬细胞上Arg-1的表达（图5E）。然而，在IL-4和IL-13存在的情况下，NETs进一步增加了MerTK（图5F），并且也显著增强了Arg-1的表达（图5G）。经DNase I处理后，NETs对MerTK和Arg- 1表达的影响被消除（图5H和5I）。进一步验证NETs对皮肤CD206hiMHCIIlo巨噬细胞的影响，我们做了一个单细胞悬浮的健康小鼠皮肤中性中性粒细胞的IL-4和IL-13（图5J），发现NETs结合IL-4和IL-13明显增强的极化CD206hiMHCIIlo巨噬细胞细胞悬浮（图5K）。这种对CD206hiMHCIIlo巨噬细胞的诱导被DNase I处理所消除（图5K）。同样，这种组合也显著增加了MerTK和Arg-1的表达，而DNase I处理也消除了它们的表达（图5L和5M）。为了确定纤维化皮肤的免疫环境，我们进行了ELISA，观察到纤维化皮肤的IL-4和IL-13显著增加（图5N和5O），表明纤维化皮肤确实可以使巨噬细胞易于CD206hiMHCIIlo群体。
Figure 6. NETs play a critical role in skin fibrosis during SSc.
为了进一步验证NETs在调节CD206hiMHCIIlo巨噬细胞驱动的皮肤损伤中的作用，我们使用DNase I在体内降解NETs。从SSc诱导后第0天开始，每隔一天腹腔注射DNase I或PBS（图6A）。Western blot分析表明，DNase I在体内降解NETs方面很有效（图6B）。流式细胞术分析显示，NETs的降解显著降低了纤维化皮肤中的CD206hiMHCIIlo巨噬细胞（图6C），但没有改变巨噬细胞总数（图6D，左）。CD64+Ly6C+成熟巨噬细胞和CD64+Ly6C成熟巨噬细胞的百分比均不受NETs降解的影响（图6D，中、右）。MerTK和TGF-β1的免疫荧光染色也显示了在DNase I处理后它们的下降（图6E）。重要的是，DNase I治疗也显著缓解了皮肤的骨质疏松，这可以通过减少皮肤厚度（图6F）、胶原蛋白含量（图6G）和α-SMA表达（图6H）来表明。这些结果进一步证明，中性粒细胞产生的NETs通过增强CD206hiMHCIIlo巨噬细胞的极化，在促进SSc皮肤纤维化中发挥重要作用。
鸣谢：Yufang shi, et al. Cellular & Molecular Immunology.
