AbMole精研抑制剂十年，最新的科研动态不断与您分享。本期与您分享的是:抑制Mcl-1协同增强Gilteritinib和MRX-2843在FLT3突变AML临床前模型中的抗白血病活性。
大约25%的AML患者发生FMS样酪氨酸激酶3 (FLT3)-内部串联重复(FLT3- ITD)突变，预后不良。FLT3抑制剂已被开发用于治疗FLT3突变AML患者，并已显示出前景，尽管会发生耐药性，这突出表明需要联合治疗来延长对FLT3抑制剂的反应。在本研究中，我们研究了选择性Mcl-1抑制剂AZD5991与FLT3抑制剂Gilteritinib和MRX-2843联合使用。这些组合可协同诱导AML细胞系和原始患者样本的凋亡。FLT3抑制剂通过抑制MEK/ERK和JAK2/STAT5通路下调c-Myc转录，导致c-Myc蛋白减少。这种对c-Myc的抑制在AZD5991的抗白血病活性中起着重要作用。有趣的是，抑制c-Myc增强了AZD5991诱导的细胞色素c释放和随后的凋亡诱导。AZD5991在体外增强FLT3抑制剂Gilteritinib和MRX-2843对FLT3突变AML的抗白血病活性，值得进一步研究。
10058-F4（Abmole，M2352，纯度>98%）是一种c-Myc抑制剂，特异性抑制c-Myc-Max相互作用，且抑制c-Myc靶基因表达的转录激活。Cytarabine (AraC)（Abmole，M2292，纯度>98%）是一种抗代谢试剂，抑制DNA合成，作用于野生型CCRF-CEM细胞时，IC50为16 nM。
Figure 3. c-Myc plays an important role in the synergistic antileukemic activity of AZD5991 and gilteritinib or MRX-2843 in FLT3-mutated AML cells.
为了开始确定这些组合的作用机制，我们进行了时间过程实验。对MOLM-13细胞进行Western blot分析显示，Gilteritinib和MRX-2843单药处理早在3 h时就下调了c-Myc蛋白(图3A)，这早于单药处理显著诱导细胞凋亡(图3B)。加入AZD5991后，Gilteritinib和MRX-2843维持了c-Myc的下调，并且与单药治疗相比，早在3 h时就显著诱导了细胞凋亡。当MV4 -11和原发性AML患者AML#262细胞治疗3 h时，也得到了类似的结果(图3C,D)。c-Myc抑制剂10058-F4在MV4-11和MOLM-13细胞中下调c-Myc，并增强AZD5991诱导的细胞凋亡(图3E,F)。此外，c-Myc敲低显著增强AZD5991、Gilteritinib和MRX-2843(单独或联合)在MV4-11细胞中诱导的凋亡(图3G)。这些结果表明，c-Myc在AZD5991与Gilteritinib或MRX-2843在AML细胞中的协同抗白血病活性中发挥重要作用。
Figure 5. FLT3 inhibition enhances AZD5991-induced cytochrome crelease.
c-Myc已被证明调节细胞色素c释放。基于此，我们假设抑制FLT3下调c-Myc会增加AZD5991诱导的细胞色素c释放，导致细胞凋亡增强(图5A)。单独使用Gilteritinib和MRX-2843抑制FLT3对细胞色素c的亚细胞定位几乎没有影响，而单独使用AZD5991处理3 h显著增加MV4-11细胞胞质部分的细胞色素c，显著降低线粒体部分的细胞色素c(图5B, c)。联合处理导致胞质部分细胞色素c进一步显著增加，线粒体部分减少。总的细胞色素c水平基本保持不变(图5D)。为了补充这一点，单独使用c-Myc抑制剂10058-F4也显著增加了细胞色素c的释放，当与AZD5991联合使用时，细胞色素c释放进一步显著增加(图5E-G)。在MOLM-13细胞中也得到了类似的结果。采用Bak/Bax双敲除模型研究了两种组合对内源性凋亡通路的激活作用。Bak/Bax双敲除几乎完全拯救了AZD5991、Gilteritinib+AZD5991和MRX-2843+AZD5991诱导的MV4-11细胞凋亡(图5I)。综上所述，这些结果表明，FLT3抑制增强了AZD5991诱导的细胞色素c释放和随后的细胞凋亡。
Figure 6. AZD5991 synergistically enhances apoptosis induced by gilteritinib and MRX-2843 in AraC-resistant AML cells.
与亲代细胞一致，在Gilteritinib或MRX-2843单独或与AZD5991联合治疗3 h后，AraCresistant细胞也显示c-Myc和p-STAT5下调(图6A)。在MRX-2843或Gilteritinib单独或联合AZD5991治疗后，MV4-11/AraC-R细胞中检测到p-ERK下调，而在MOLM13/AraC-R细胞中无p-ERK下调。Gilteritinib或MRX-2843单独或联合AZD5991下调c-Myc蛋白时，c-Myc转录水平显著降低(图6B)。与亲代细胞一致，AZD5991单独处理导致c-Myc转录水平显著增加。在治疗早期，AZD5991治疗显著增强了Gilteritinib和MRX-2843诱导的细胞凋亡(图6C)。AZD5991联合Gilteritinib或MRX-2843治疗24 h，可协同诱导细胞凋亡(图6D)。JAK2抑制剂AZD1480单独或与AZD5991联合处理显著降低了AraC-R细胞中的c-Myc转录水平(图6E)，同时显著降低了c-Myc蛋白水平(图6F)。与亲代细胞一致，AZD1480 (JAK1/2抑制剂)和AZD5991 (Mcl-1抑制剂)处理3 h后显著诱导AraC-R细胞凋亡(图6G)。AZD5991联合Gilterinib或MRX-2843还可协同诱导来自FLT3-ITD和-TKD AML患者的原代AML细胞凋亡，该患者在诱导3化疗后未能实现缓解(图6H)。这些结果表明，联合抑制Mcl-1和抑制FLT3对化疗耐药AML细胞具有良好的抗白血病活性，而联合抑制FLT3通过JAK2/STAT5途径抑制c-Myc在联合抑制AZD5991和联合抑制Gilteritinib或MRX-2843抑制FLT3的作用机制中起着重要作用。
鸣谢：Shuangshuang Wu, et al. Cells. 2022 Sep 3;11(17):2752.
