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鱼粉因其蛋白质含量高、含有多种必需氨基酸、容易被吸收等多种优点,目前是水产饲料中主要的蛋白质源。自我国水产饲料行业兴起以来鱼粉的使用量逐年增加。
水产养殖业的快速发展与鱼粉资源的缩减造成鱼粉价格飙升,饲料成本大大增加。
一般对虾饲料中鱼粉的用量不低于20%,在配合饲料中降低鱼粉用量后,养殖对虾会出现生长缓慢、抗病力低下等问题。
因此,寻求在低鱼粉条件下可提高对虾的生长和非特异性免疫力的抗生素替代品成为近年来对虾营养研究的热点。
凡纳滨对虾具有生长速度快、盐度适应广、高投入高回报等优点,自引入我国以来养殖规模迅速扩大,现养殖产量已居对虾类第1位。
近年来频频发生的病害给对虾养殖产业造成相当大的经济损失,严重阻碍对虾养殖产业发展,主要原因在于养殖密度过大,抗生素的大量使用等。
寻找有效的病害防治措施,以期降低损失,提高养殖成功率,并实现降抗甚至是无抗养殖,是目前对虾养殖中亟待解决的关键瓶颈问题。
益生菌是指在一定范围内可通过抑制有害微生物生长,补充养分、刺激免疫系统来增进宿主健康的活体微生物制剂；
益生菌具有无毒副作用,无残留,促进动物生长,提高饲料转化率等诸多优点,是抗生素的良好替代品。
枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌,是一类好氧型细菌,具有耐高温、耐胆盐、耐酸性等特性,在极端环境下会产生内源性孢子,在饲料制粒之后也能保持极高的存活率。
枯草芽孢杆菌在机体内消耗氧气,释放丙酸、乙酸,丁酸等,可创造一个厌氧微酸环境,促进有益厌氧菌生长,抑制有害菌生长,调节肠道微生态平衡,增强抗毒,抗病能力,还可以产生多种消化酶如淀粉酶、蛋白酶等促进饲料降解,提高饲料利用率。
近几年,枯草芽孢杆菌在水产动物养殖上的应用研究已成为热点。
水产研究社查阅资料已经证实饲料中添加枯草芽孢杆菌可促进凡纳滨对虾的生长并可提高机体内非特异性免疫酶活性。
目前,枯草芽孢杆菌对凡纳滨对虾影响的研究大多仅限于考察对其生长和饲料利用的影响；
而对于枯草芽孢杆菌在低鱼粉饲料条件下对凡纳滨对虾非特异性免疫酶活性与 mRNA 表达影响的研究则较少。
因此，本试验拟在低鱼粉饲料中加不同比例的枯草芽孢杆菌,探讨其对凡纳滨对虾幼虾生长性能,非特异性免疫活性、肝胰腺非特异性免疫酶 mRNA 表达及抗病力的影响,为枯草芽孢杆菌在低鱼粉饲料中的应用提供理论基础和技术支撑。
1 材料与方法
1.1 饲料配制
以红鱼粉、豆粕、花生粕作为配方中的主要蛋白质源,鱼油、大豆油、大豆卵磷脂作为配方中的主要脂肪源,配制鱼粉含量为10%的低鱼粉饲料，其组成及营养水平见表1。
在低鱼粉饲料中分别添加0、0.10%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%和1.25%的枯草芽孢杆菌。
试验用枯草芽孢杆菌菌种来源于广东省微生物菌种保藏中心(GIM:1.222)，通过复苏扩配成活菌数为1.0x10的8次方CFU/mL的菌液,在加水搅拌环节溶于水中按照试验设计的添加量添加于低鱼粉饲料中。
饲料原料经粉碎处理后按配方准确称取使用量。
其中,大宗原料先于V型混合机中混合 10 min,微量元素等通过逐级扩大法混合均匀,然后以双螺杆挤条机(F-26 华南理工大学,广州)加工成直径为1.5 mm 的成品料,在烘箱(60 ℃)中静置30 min,风干后分装放于-20 ℃冰箱备用。
1.2 饲养管理
养殖试验在广东省湛江市广东海洋大学东海岛海洋生物研究基地进行,试验用凡纳滨对虾虾苗购于湛江粤海虾苗厂。
虾苗于室外水泥池暂养30 d后,挑选初始均重为(0.40±0.01)g的健康个体 840尾,随机分为7组,每组3个重复,每个重复40 尾,以重复为单位养殖于 0.3m³的玻璃纤维钢桶中。养殖周期为8周。
试验期间按照体重的8%~10%投喂,每天投喂4次(07:00、11:00.17:00和 21:00),根据天气、摄食和生长情况相应调整投喂量,试验前期(前6周)每2d换水1次，试验后期(后2周)每天换水1次,换水量为总水量的 2/3。
试验期间,给养殖水体不断充气,使溶解氧浓度达到5~6 mg/L,水温为(30.5±0.8)℃盐度为 29~31,pH 为7.8~8.2,氨氮浓度低于0.03 mg/L.
2 结果与分析
2.1 低鱼粉饲料中添加枯草芽孢杆菌对凡纳滨对虾幼虾生长性能的影响
由表3可知,低鱼粉饲料中添加不同比例的枯草芽孢杆菌对凡纳滨对虾幼虾的存活率无显著影响(P>0.05)。
增重率与特定生长率随枯草芽孢杆菌添加量的增加呈先上升后下降趋势,二者在添加量为0.75%时最高,除0.10%组外的各添加组均显著高于对照组(P<0.05)；
枯草芽孢杆菌添加量为 0.75%时,饲料系数最低,显著低于其他各组(P<0.05),对照组饲料系数最高,显著高于除0.10%组外的各添加组(P<0.05);
而蛋白质效率的变化规律则与饲料系数相反,以0.75%组最高，显著高于其他各组(P<0.05),以对照组最低,显著低于除0.10%组外的各添加组(P<0.05)。
以增重率为判断依据,根据折线模型(图1)得出,低鱼粉饲料(鱼粉含量为10%)中添加0.73%的枯草芽孢杆菌可促进凡纳滨对虾幼虾的生长。
2.2 低鱼粉饲料中添加枯草芽孢杆菌对凡纳滨对虾幼虾血清非特异性免疫酶活性的影响
由表4 可知,血清酸性磷酸酶、过氧化氢酶、酚氧化物酶和溶菌酶活性随枯草芽孢杆菌添加量的增加先升高后降低,分别在添加量为1.00%1.00%、0.50%和 0.75%时获得最高值,同时各添加组血清酸性磷酸酶、过氧化氢酶和溶菌酶活性均显著高于对照组(P<0.05),除0.10%组外的各添加组血清酚氧化物酶活性显著高于对照组(P<0.05)。
各添加组血清碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性均显著高于对照组（ Ｐ＜0.0５） ，且二者均在枯草芽孢杆添加量为0.7５％有最高值。
2.3 低鱼粉饲料中添加枯草芽孢杆菌对凡纳滨对虾幼虾肝胰腺非特异性免疫酶 mRNA 表达的影响
由图2和图3可知,肝胰腺中过氧化氢酶和溶菌酶mRNA相对表达量随枯草芽孢杆菌添加量的增加呈先升高后下降趋势,均在添加量为1.00%时达到最大值,各添加组肝胰腺中过氧化氢酶mRNA 相对表达量均显著高于对照组(P<0.05)，0.50%、0.75%、1.00%和1.50%组肝胰腺中溶菌酶mRNA 相对表达量显著高于对照组(P<0.05)。
2.4 低鱼粉饲料中添加枯草芽孢杆菌对凡纳滨对虾幼虾抗病力的影响
由图4可知,经哈维氏弧菌攻毒 96 h后,凡纳滨对虾幼虾的累积存活率随枯草芽孢杆菌添加量的增加先升高后趋于稳定,具体表现为0.50%0.75%、1.00%和1.50%组显著高于对照组(P<0.05).0.10%和0.25%组与对照组差异不显著(P>0.05)。
3 讨论
3.1 低鱼粉饲料中添加枯草芽孢杆菌对凡纳滨对虾幼虾生长性能的影响
近年来,降低水产饲料中鱼粉的使用量而又不影响饲料营养价值方面的研究逐渐增多。
枯草芽孢杆菌是饲料添加剂中常用的益生菌,对水产动物等具有促进生长的作用。
本试验结果表明,在低鱼粉饲料中添加适量枯草芽孢杆菌可显著提高凡纳滨对虾幼虾的增重率、特定生长率,并显著降低饲料系数。
在枯草芽孢杆菌添加量为0.75%时,凡纳滨对虾幼虾的增重率、特定生长率均显著高于对照组,饲料系数显著低于对照组；
以增重率为判断依据,通过折线模型可知,促进凡纳滨对虾幼虾生长的饲料中枯草芽孢杆菌的适宜添加量为0.73%。
上述结果表明,在低鱼粉饲料中添加适量的枯草芽孢杆菌能能更好地促进凡纳滨对虾幼虾的健康生长。
枯草芽孢杆菌促进凡纳滨对虾幼虾生长，可能与其创造酸性环境、抑制有害菌生长、调节肠道微生态平衡、产生多种消化酶等作用有关。
另外,从本试验结果看,枯草芽孢杆菌添加量过高反而抑制凡纳滨对虾幼虾生长,可能是过量的枯草芽孢杆菌会抑制其他有益菌生长,造成肠道有益菌群生态失衡,从而导致凡纳滨对虾生长缓慢，更深层次的原因还有待深入研究。
3.2 低鱼粉饲料中添加枯草芽孢杆菌对凡纳滨对虾幼虾血清非特异性免疫酶活性及肝胰腺非特异性免疫酶 mRNA 表达的影响
酚氧化酶,溶菌酶活性是检测凡纳滨对虾免疫力的重要指标。
本试验中,凡纳滨对虾幼虾血清酚氧化酶、溶菌酶活性随枯草芽孢杆菌加量的增加呈先升高后降低趋势,分别在添加量为0.50%和0.75达到最大值,说明加枯草芽孢杆菌对血清中酚氧化酶、溶菌酶活性起到积极促进作用；
这与谢佳磊等研究得出的枯草芽孢杆菌(5x10的9次方CFU/kg)对克氏原蝥虾血清溶菌酶和酚氧化酶活性影响的结果相似。
超氧化物歧化酶、过氧化氢酶能够有效地除自由基,活性氧,防止生物分子方面的损伤,起到免疫抗病作用。
本试验中,各添加组血清过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性均显著高于对照组,且在桔草芽孢杆菌加量为1.00%时二者达到最大值,表明低鱼粉饲料中添加适量枯草芽孢杆菌可提高血清中过氧化氢酶和超氧化物歧化酌活性,这与张春晓等、胡毅等以枯草芽孢杆菌饲喂凡纳滨对虾后所得结果相似。
酸性磷酸酶和碱性磷酸酶对于生物体内物质可以快速的摄取与转运,是机体免疫抗病不可缺少的重要免疫酶。
本试验结果表明,低鱼粉饲料中添加枯草芽孢杆菌能够有效地提高血清酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性,提高机体免疫力,这与王苓等得出的添加芽孢杆菌(1x10的9次方CFU/kg)对凡纳滨对虾血清非特异性免疫活性影响的结果一致。
本试验中,各添加组血清非特异性免疫活性均较对照组有所提高,但其峰值不一样,可能是由于枯草芽孢杆菌对不同非特异性免疫酶的活性促进作用效价范围不一致所导致。
过氧化氢酶具有防止自由基形成、维持免疫系统平衡、保护个体组织免受病毒侵害的重要作用；溶菌酶可以辅助判断机体非特异性免疫机能。
研究这2种酶mRNA 的表达情况可以探讨凡纳滨对虾幼虾相关非特异性免疫酶活性与其mRNA 表达的关系以及枯草芽孢杆菌的作用方向,为更深层次的研究做铺垫。
本试验中,各添加组凡纳滨对虾幼虾肝胰腺中过氧化氢酶和溶菌酶mRNA 的相对表达量均高于对照组,且均在添加量为1.00%最高,这与血清中这2种活性变化的趋势基本一致,枯草芽孢杆菌提高凡纳滨对虾幼虾非特异性免疫力可能是通过上调相关基因的表达面实现的。
由此可以得出,添加枯草芽孢杆菌能够提高凡纳滨对虾肝胰腺中非特异性免疫酶mRNA 的表达,这与丁品等、张盛静等饲喂凡纳滨对虾含有芽孢杆菌的饲料时得出的试验组溶菌酶RNA相对表达量显著高于对照组的研究结果相同。
3.3 低鱼粉饲料中添加枯草芽孢杆菌对凡纳滨对虾幼虾抗病力的影响
凡纳滨对虾养殖过程中,病害是造成其养殖成功率低的主要原因,对虾存活率的多少是其抗病力的外在直观体现,哈维氏弧菌是凡纳滨对虾致病率比较高的有害菌之一。
本试验中,在养殖试验结束后,凡纳滨对虾幼虾肌肉注射哈维氏弧菌,观察记录96h后的累积存活率。
结果发现，凡纳滨对虾幼虾的累积存活率随着枯草芽孢杆菌添加量的增加先增加然后在较高的水平上保持稳定,说明添加芽孢杆菌能够有效地提高凡纳滨对虾幼虾的抗病力,这与沈文英等以白斑综合征病毒感染凡纳滨对虾的研究结果相似。
枯草芽孢杆菌可提高凡纳滨对虾幼虾的抗病力可能与芽孢杆菌细胞壁的主要成分肽聚糖有关,肽聚糖可刺激水产动物免疫因子活性提高,进面提高其抗病力。
结 论
综上所述,在低鱼粉饲料中添加适量的枯草芽孢杆菌可促进凡纳滨对虾幼虾生长,提高非特异性免疫力和抗病力。
以增重率为判断依据,通过折线回归模型分析得出低鱼粉饲料(鱼粉含量为10%)中添加0.73%的枯草芽孢杆菌(活菌数为1.0x10的8次方CFU/mL)时促生长效果最佳。
