AbMole精研抑制剂十年，最新的科研动态不断与您分享。本期与您分享的是:固体纳米颗粒上的胆汁酸偶联增强了ASBT介导的内吞作用和乳糜微粒途径，但通过诱导细胞负反馈回路中的转运流来减弱胞吞作用。

胆汁酸修饰纳米颗粒通过利用与胆汁酸转运蛋白的特异性相互作用，为提高低渗透性药物的口服生物利用度提供了一种方便的策略。然而，其潜在机制尚不清楚，特别是考虑到游离胆汁酸（回肠）和从胆汁酸乳化脂肪滴（十二指肠）中消化的脂肪分子的吸收位点不同。本文合成了糖胆酸（GCA）偶联聚苯乙烯纳米颗粒（GCPNs），并研究了它们在Caco-2细胞模型中的转运。GCA偶联通过与根尖钠依赖的胆汁酸转运体（ASBT）的相互作用来增强摄取。确定了与ASBT和乳糜微粒途径相关的新途径同时，与未修饰的纳米颗粒(CPNs)相比，较高的GCPNs摄取不会导致相同程度的胞吞。药理学和基因组学研究证实，GCA偶联改变了细胞内吞机制，并在基因水平下调了细胞对基因水平转运的响应，这是一个负反馈循环，并解释了gcpn较高的细胞滞留。这些发现为胆汁酸纳米药物的设计提供了坚实的基础，利用ASBT介导的吸收的优势，同时也启发我们用更先进的技术综合考虑细胞反应。

Dynasore（Abmole，M2569，纯度>99%）是一种可渗透细胞的，可逆的，非竞争性的dynamin（发动蛋白）抑制剂，抑制dynamin 1/2的GTPase活性，IC50为15μM，也抑制线粒体dynamin Drp1，对其他小GTP酶没有作用效果。ZCL278（Abmole，M2562，纯度>98%）是一个选择性的Cdc42 GTP酶抑制剂，Kd为11.4μM。

Figure 2. Endocytosis mechanisms of CPN and GCPN in Caco-2 cells.

为了阐明特定的内吞途径，对温度和药理抑制剂的影响进行了测试。如图2a所示，CPN和GCPN在Caco-2细胞中均表现出温度依赖性的摄取，在20℃时内吞作用减弱，在4℃时摄取抑制更强。众所周知，内吞作用是一个活跃的过程，在37℃时依赖能量，可被低温(4℃)抑制在20℃左右，可以诱导许多异常变化，包括不规则扩展的迷宫通道网络，涂层坑和囊泡，管状元件和α液泡，此外，在拐点(20-25℃)处，细胞膜形态也发生了微域分离、液相转变和蛋白质构象变化，这些结果表明，CPN和GCPN的摄取都依赖于能量依赖的内吞方式，并依赖于正常的细胞膜形态。

图2b显示了抑制剂对Caco-2细胞中CPN和GCPN内化的影响。制霉菌素、染料木素、Dynasore和CytD均不同程度抑制CPN和GCPN的内吞作用，表明Caco-2细胞中CPN和GCPN均通过小泡介导途径内化，由肌动蛋白丝驱动，并在动力蛋白的帮助下促泡出芽。相反，EIPA对CPN或GCPN的摄取没有抑制作用。因此，大胞饮作用与CPN或GCPN的摄取无关。CPN和GCPN摄取之间最明显的差异是氯丙嗪(CPZ)的作用，氯丙嗪是网格蛋白介导途径的抑制剂。网格蛋白介导的细胞内吞作用是细胞表面向细胞内转移的最常见的囊泡运输过程之一。如图2b所示，CPZ处理显著阻碍了CPN的内吞，而Caco-2细胞中GCPN未受影响，说明GCA偶联改变了NPs的运输路线，使其远离网格蛋白介导的通路。

CPN和GCPN的摄取被动力蛋白抑制是合理的，因为网格蛋白和小泡介导的内吞作用都依赖于它的活性，然而，其他一些被称为“网格蛋白/小泡独立内吞作用”的摄取机制可能不与动力蛋白相关。虽然不像网格蛋白/小泡介导的内吞作用那样典型，但它们也可能参与CPN/GCPN的摄取。为了澄清这一问题，我们用siRNA转染敲除Flot-1、Arf6和RhoA，并用定量聚合酶链反应（图2c-e）。对于cdc42，用ZCL278抑制其作用如图2d,e所示，Arf6沉默部分阻断了GCPN的摄取，而cdc42抑制增强了CPN的内化。这一结果表明，CPN和GCPN在网格蛋白/小泡独立的内吞过程中是多样化的。对于GCPN，只有Arf6参与了内化，而CPN的摄取则涉及一个更复杂的机制。抑制cdc42导致了更高的吸收率，这可能是由于其他途径的激活。因此，cdc42至少对CPN的摄取有反应，并在这一过程中发挥了一定作用。

鸣谢：Feiyang Deng, et al. Adv Sci (Weinh). 2022 Jul;9(21):e2201414.