科研科研日常 自噬 LC3 最近一直有同学询问自噬检测相关问题，特地以文献举例来说明一下常规自噬检测方式。 [向右R][向右R][向右R]自噬发生过程主要分为5个阶段：（1）起始，（2）核化，（3）延伸，（4）自噬体与溶酶体融合，（5）自噬体裂解。LC3贯穿整个自噬过程，是目前公认的自噬标记，其功能是塑造不断生长的吞噬细胞 并参与货物招募 。LC3蛋白合成后被Atg4剪切掉C端5肽，暴露甘氨酸残基，产生胞浆定位的LC3-I。在自噬过程中，LC3-I会被包括Atg7和Atg3在内的泛素样体系修饰和加工，与PE相偶联，形成LC3-II并定位于自噬体内外膜上。自噬体和溶酶体融合后，外膜上的LC3-II被Atg4切割，产生LC3-I循环利用。自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡和内体融合形成完整的自噬体。 然后与溶酶体融合（不完全自噬发生时不会与溶酶体融合）。 [向右R][向右R][向右R]检测自噬是否发生，LC3的切割是必不可少的。生化实验以LC3II/LC3I灰度分析的比值来进行统计。有同学问是否可以以LC3II/内参来做比值，严格来说这么做可能会被审稿人问，如果不是存在抗体确实只能检测一条带的情况，尽量II/I。P62作为典型自噬受体，并非自噬检测金标准，P62的升高或者降低在一定程度上说明自噬的发生是不完全自噬还是完全自噬。但因为P62本身调控比较复杂，还可能存在泛素化等调控。所以有时候检测到明显的LC3变化，P62变化可能不同情况都有，以LC3的变化为主。同时还可以通过自噬晚期抑制剂实验来初步确定自噬发生的类型。 [向右R][向右R][向右R]除生化实验外，组织可以以电镜检测自噬体作为辅助，细胞上荧光实验也必不可少。LC3的荧光检测分为单荧光或者双荧光。双荧光实验的原理如下：GFP是酸敏感型GFP蛋白，而RFP是稳定的荧光表达基团，不受酸性pH影响。完全自噬发生时，自噬体与溶酶体进行融合，形成自噬溶酶体。自噬溶酶体由于溶酶体内部的酸性环境，导致GFP淬灭，因此，GFP的减弱可指示自噬溶酶体形成的顺利程度，GFP越少，则从自噬小体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之，自噬小体和溶酶体融合被抑制，自噬溶酶体进程受阻。RFP是一直稳定表达的，因而可以通过GFP与RFP的亮点比例来评价自噬流进程。此外还可以以LC3和溶酶体的共定位来判定自噬的类型。 [向右R][向右R][向右R]有同学问是否需要用qPCR来检测LC3？不需要！一般来说当你确定了一个靶标蛋白，想知道模型下该靶标的变化时，可以通过qPCR和WB来确定该靶标的变化。