AbMole精研抑制剂十年，最新的科研动态不断与您分享。本期与您分享的是：无功能小鼠和人肝细胞作为3D类器官的长期扩张。

哺乳动物肝脏具有显著的再生能力。已经描述了两种损伤反应模式：（1）当所有肝细胞都受到慢性肝病影响时，“卵形细胞”反应从胆管发出。(2) 部分肝切除术 (PHx) 等急性肝损伤时，成熟肝细胞会发生大量增殖反应。虽然卵圆细胞反应已通过从胆管肝细胞中生长的类器官在体外被捕获，但肝细胞增殖反应尚未在培养物中重现。在这里，我们描述了为小鼠和人类原代肝细胞建立的长期 3D 类器官培养系统。类器官可以从单个肝细胞建立并生长数月，同时保留关键的形态、功能和基因表达特征。类器官的转录谱类似于 PHx 后增殖的肝细胞的转录谱。人类肝细胞类器官在移植到小鼠体内后大量增殖，从而重现了肝细胞的增殖性损伤反应。

Figure 1. Establishment of 3D Culture System of Murine Hepatocyte Organoids

在培养基中添加了Y-27632，并用于类器官的培养呵孵育。详细来说，分离的肝细胞通过 70毫米过滤器过滤，用冷的 AdDMEM/F12 洗涤两次，计数并与悬浮板中的 Matrigel 混合。24孔板的每孔使用 20,000-50,000 个细胞。 Matrigel 固化后，加入 Hep-Medium。 Hep 培养基由 AdDMEM/F12（含 HEPES、GlutaMax 和青霉素-链霉素）和 15% RSPO1 条件培养基（自制）、B27（不含维生素 A）、50ng/ml EGF、1.25mM 组成 N-乙酰半胱氨酸、10 nM 胃泌素、3 mm CHIR99021、25ng/ml HGF、50ng/ml FGF7、50ng/ml FGF10、1 mM A83-01 、10 mM 烟酰胺和 10 mM Rho 抑制剂Y-27632。接种后14天，类器官被机械破碎并重新接种到新的基质胶中。在培养过程中，最多每三天更新一次培养基。类器官通常每 7-10 天以 1:3 的分流比传代。

Y-27632 (Abmole, M1817，纯度 99.66%) 是一种选择性的ROCK1(p160ROCK)抑制剂，Ki为140 nM，比对其他激酶包括PKC，cAMP依赖性蛋白激酶， MLCK和PAK的作用强200多倍。 Y-27632也同等有效抑制ROCK-II。Y-27632作用于PKC, cAMP依赖的蛋白激酶和 肌球蛋白轻链激酶(MLCK)几乎没有活性，Ki分别为26 μM, 25 μM, 和 > 250 μM。Y-27632通过选择性抑制Ca2+敏感化，而抑制多种兴奋剂而不是KCl，包括Phenylephrine, Histamine, Acetylcholine, Serotonin, Endothelin,和Thromboxane诱导的平滑肌收缩，IC50为0.3-1μM。

鸣谢：Huili Hu, et al. Cell. 2018 Nov 29;175(6):1591-1606.e19.