科研 共聚焦显微镜 共聚焦 荧光串色 研究生学习 继续橙子🍊同学的共聚焦成像图问题解答。🍊同学的共聚焦拍摄问题也可能是其他研究生也会遇到的。最近🍊同学在GFP/mcherry双荧光成像上一直遇到荧光串色的问题，mcherry通道总是能收到来自GFP通道的荧光串色，非常影响实验。橙子同学向猫老师请教为什么会出现荧光串色以及如何避免荧光串色？猫老师特地询问了橙子同学的拍摄参数并进行分析： [一R]🍊同学提供了GFP以及mcherry荧光通道的发射图谱参数，GFP的发射图谱🍊同学选择在500nm-545nm之间，没有问题。但🍊同学刚开始把mcherry的通道发射光谱选择为560-595nm左右，我们从mcherry自身的荧光图谱可以看到，mcherry的最大发射差不多在600 nm之后，🍊同学的光谱接收范围就不在其最大接收范围内，相当于你选择的mcherry通道就不合适，荧光相对来说弱，为了达到相应的荧光强度又会提高激光强度和增益，最后造成串光干扰增大和背景增高。 [一R]于是🍊同学就更改了发射光谱的范围，可能是太害怕串光，这次调整的范围直接绿光500-510nm，红光也是调整在10nm左右的带通接收范围，这样子荧光就更接收不到了，即便不串光荧光也没有了，如果再继续提高激光强度和增益，又会遇到上面同样的问题，得不偿失。🍊同学又继续进行拍摄参数调整。 [二R]在后续的调整中，🍊同学把光谱的接收范围缩窄但囊括了荧光蛋白最大接收范围，且把两个光谱发射重叠的部分排除掉减少串光，因为接收范围大，不需要打到很高的激发强度和增益也能检测到荧光，最大限度减少串光干扰和背景。 [三R]但是🍊同学发现激光强度，发射图谱都进行优化后，且分通道扫描依然存在串光问题，mcherry通道还是有来自GFP通道的光。 [三R]这时候猫老师请教了徕卡的工程师，工程师建议先进行下检测，即关闭mcherry通道，只打开GFP通道看mcherry通道能不能检测到来自GFP的荧光。即只用488激光激发，用两个检测器分别检测500-540nm，590-650nm，再看下590-650nm通道是否有光，结果发现有光，这个时候可能和仪器本身的滤片有关系，只能找工程师过去进行检测看看情况。于是🍊同学赶紧联系了片区徕卡工程师，期待橙子同学后续反馈[斜眼R][斜眼R]。