三、电泳 制胶与灌胶 提前洗净玻璃板，确保无杂质影响电泳效果。 配胶时充分混匀（可适当超声，但时间不宜过长） 分离胶聚合时间控制在1020分钟（未完全凝聚），浓缩胶最佳聚合时间为810分钟 加完分离胶后可以加入纯化水等压平分离胶，使分离胶凝成一条直线 电泳操作： 电泳液混匀后使用，液面需没过短玻板 使用新配置的电泳液，防止电泳缓冲液放置时间过长影响电泳效果 上样前涡旋相同次数，确保样本均匀性 上样时缓慢操作，避免在孔的左右角用力加样，以免因胶孔不均出现哑铃条带 设置同批次的阳性对照 观察溴酚蓝的位置，及时调整电泳条件。 四、电转 三明治结构 确保三明治结构夹紧，滤纸起毛之后及时更换。 显影后出现两边重、中间浅的情况，可能是转膜夹子太紧或不平整导致的。 电转条件 电转液浑浊后需换新。 电泳期间进行冰水浴，防止发热损伤蛋白。 五、封闭及孵育 封闭操作 封闭时间控制在2小时左右，时间过少会导致非特异性结合位点多、背景脏；时间过长则信号低。 封闭液中加入适量的防腐剂，避免封闭蛋白变性影响封闭效果 孵育抗体 孵育磷酸化的蛋白时，推荐使用2%BSA，脱脂牛奶可能会导致信号丢失。 一抗的孵育时间通常为16~24小时，过短可能导致抗原抗体结合不充分从而致使信号丢失。 洗膜时短时间多次勤换TBST，若洗脱效果不好可以多加一点Tween20 所有液体不要直接冲到膜上，从容器的边缘加或慢慢从膜的边缘加。 六、曝光与结果分析 曝光操作 快速滴加发光液后反过来进行20~30秒的孵育，再进行曝光，以获得更均匀的结果。 如果条带信号较低，可以尝试使用灵敏度较高的发光液、延长曝光时间或提高抗体浓度。 结果分析 根据曝光结果分析蛋白质的存在、含量及分子量大小 注意观察条带的形态和颜色深浅，以判断实验结果的可靠性 七、实验后处理 清理实验台 实验完毕后先清理实验台，再收拾所有实验器材。 记录与总结 作好实验记录，包括实验步骤、试剂用量、实验结果等 总结实验经验，分析可能存在的问题和改进措施。 综上所述，WB实验需要注意的细节包括实验前准备、样本制备、电泳、电转、封闭及孵育、曝光与结果分析以及实验后处理等多个方面。只有严格遵守实验流程并注重细节处理，才能获得准确可靠的实验结果。以上仅供参考