最终延伸与贮存:
30~35个循环结束后,在68~74°C的温度下进行最终延伸约5~10分钟,以充分延伸剩余的单链DNA。
最终产物可以在PCR机器中维持温度在4~10°C保存。
电泳检测:
将PCR产物进行琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳,以检测扩增产物的特异性和大小。
如在反应管中加有石蜡油,需用氯仿进行抽提反应混合液,以除去石蜡油;否则,直接取适量电泳检测。
三、注意事项
实验环境:PCR实验应在没有DNA污染的干净环境中进行,最好设立专用的PCR实验室。
试剂质量:所有试剂都应无核酸和核酸酶的污染,使用高质量的新鲜双蒸水配制试剂,并采用滤膜过滤除菌或高压灭菌。
操作规范:操作过程中应戴手套,避免交叉污染。试剂或样品准备过程中使用一次性灭菌的塑料瓶和管子,玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
引物设计:引物是决定PCR结果的关键,应确保引物的特异性、长度、Tm值和GC含量等参数符合要求。
温度控制:PCR过程中的温度控制至关重要,应确保变性、退火和延伸步骤的温度和时间准确无误。以上仅供参考