在WB实验中，获得一张“漂亮”的实验图不仅是科学数据的要求，也能够增强结果展示的效果。以下是一些关键的步骤和技巧： [一R]优化样品制备 蛋白提取：确保样品蛋白提取充分，减少降解，避免杂质干扰。 蛋白定量：准确测定蛋白浓度，确保每个样品的上样量一致，避免条带浓度差异过大。 样品缓冲液：使用新鲜的SDS-PAGE样品缓冲液，避免样品变质导致条带模糊。 [二R]电泳过程控制 适合的凝胶浓度：根据蛋白分子量选择适当的分离胶浓度。 样品加样：尽量均匀地加样，避免蛋白泄漏，影响条带形状。 跑胶时间控制：预染蛋白Marker的标准线条带作为跑胶的参考，确保蛋白迁移到理想的分辨位置，防止条带偏斜或扩散。 [三R]转膜条件优化 选择合适的转膜参数：根据蛋白分子量选择湿转或半干转。大分子量蛋白一般适合湿转，使用低电压和较长时间，而小分子量蛋白适合半干转。 选择膜材：PVDF膜对于高分子量蛋白吸附效果较好，通常适用于较宽范围的分子量检测。 转膜质量检测：在转膜后用Ponceau S染色检测膜上蛋白分布，确保转膜均匀。 [四R]抗体的选择和稀释 使用高质量抗体：确保抗体特异性和敏感度。 优化抗体稀释度：进行梯度稀释实验，找到最佳的一抗和二抗稀释比例，避免背景干扰。 封闭时间和封闭剂：确保封闭充分且时间不宜过长，可使用5%脱脂奶粉或快封试剂，避免非特异性结合。 [五R]发光试剂的选择 灵敏度选择：根据目标蛋白丰度选择发光灵敏度合适的化学发光试剂，避免高丰度蛋白过曝或低丰度蛋白信号太弱。对于低丰度蛋白，可选用超敏型发光试剂。 均匀涂布：试剂在膜上均匀涂布，避免条带不均。 [六R]曝光和成像 曝光时间控制：从短时间曝光开始，避免条带过曝。对于高灵敏度发光试剂，最好控制曝光时间，保证条带清晰锐利。 使用数字成像设备：如果条件允许，尽量使用数字成像系统（如ChemiDoc），获得更高分辨率的条带图像。 调整对比度和亮度：在ImageJ或Photoshop等软件中适当调整对比度和亮度，增强条带细节和清晰度。 [七R]背景清除和数据处理 清除背景：避免使用过多的发光试剂，背景过高时会影响条带清晰度，尽量使用特异性更好的抗体。 图像修整：确保条带整齐，裁剪时保持重要标记（如Marker）的条带可见，避免影响对比效果。 [八R]选择合适的内参抗体 根据目标蛋白的分子量和丰度，选择合适的内参抗体（如GAPDH、β-Actin等），确保内参条带不与目标蛋白条带重叠，并且在实验条件下表达稳定。