AbMole精研抑制剂十年，最新的科研动态不断与您分享。本期与您分享的是:Lnc-HZ08通过促进PI3K泛素降解调节与流产相关的BPDE诱导的滋养层细胞功能障碍。
越来越多的证据表明，BaP(苯并(a)芘)环境可能导致孕妇流产。此外，BaP的最终代谢物BPDE(苯并(a)芘-7,8-二氢二醇-9,10-环氧化物)可诱导人滋养层细胞功能障碍。然而，很少有流产与滋养层功能障碍相关。此外，它们的基本机制在很大程度上仍未查明。在本研究中，一种新型lncRNA(长链非编码RNA) lnc-HZ08在人复发性流产(RM)组织和BPDE处理的人滋养层细胞中被鉴定为高表达。LncHZ08作为RNA支架与PI3K及其泛素连接酶CBL (CBL原癌基因)相互作用，增强两者的蛋白相互作用，促进PI3K泛素降解。在RM组织和BPDE处理的滋养细胞中，lncHZ08启动子区DNA甲基化水平降低，促进雌激素受体1(雌激素受体1,ER)介导的lncHZ08转录。随后，上调的lnc-HZ08下调了PI3K水平，抑制了PI3K/p-AKT/pP21/CDK2通路，从而减弱了人滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭，进而导致流产。这些结果可能为不明原因流产的发生提供新的科学和临床见解。
Cycloheximide（Abmole，M4879，纯度>99%）是一种蛋白生物合成(protein synthesis)的抑制剂, IC50值为532.5 nM。Cycloheximide也是一种抗真菌(antifungal)素，Cycloheximide还可抑制铁死亡(ferroptosis)并抑制自噬(autophagy)。740 Y-P（Abmole，M9389，纯度>98%）是一种有效，具有细胞渗透性的PI3K磷酸肽激活剂。LY294002（Abmole，M1925，纯度>99%）是第一个人工合成的PI3Kα/δ/β的抑制剂，IC50分别为0.5μM/0.57μM/0.97μM，在溶液中比在Wortmannin中稳定，也能够抑制自噬体的形成。Decitabine（Abmole，M2052，纯度>99%）是一种DNA甲基化的有效抑制剂，作用于HL-60和KG1a细胞时，IC50分别为100 ng/mL和1 ng/mL。MG132（Abmole，M1902，纯度>98%）是一种蛋白酶体抑制剂，IC50为100 nM，也抑制钙蛋白酶，IC50为1.2μM。MG132可以抑制NLRP1的活化。
Fig. 2 Lnc-HZ08 suppresses PI3K/p-AKT/p-P21/CDK2 pathway in human trophoblast cells.
已知lnc-HZ08抑制滋养细胞增殖、迁移和侵袭，探索lnc-HZ08可能调控的相应信号通路。为了识别这一通路，我们将lnc-HZ08过表达质粒或空载体转染Swan 71细胞，然后进行转录组测序。实验上，lnc-HZ08过表达抑制了PI3K和AKT的蛋白水平，以及它们的下游p-P21和CDK2，lnc-HZ08的敲低增加了这些蛋白质的水平(图2a)。以上结果表明，一种新的lnc-HZ08可能下调人滋养层细胞中PI3K/p-AKT/p-P21/CDK2信号通路。
为了验证lnc-HZ08是否通过PI3K和p-AKT抑制p-P21和CDK2，我们用PI3K激活剂（740 Y-P）或p-AKT抑制剂（LY294002）处理滋养层细胞。740Y-P能与PI3K的一个亚单位p85特异性结合，并增加哺乳动物C2成肌细胞的PI3K活性。LY294002抑制PI3K的磷酸化活性并降低其下游p-AKT的水平。我们发现740Y-P提高了该PI3K/p-AKT/p-P21/CDK2途径的蛋白水平。然而，这种上调通过过量表达lnc-HZ08而减弱（图2b）。用LY294002处理可以下调pAKT/p-P21/CDK2途径的蛋白水平。然而，这种下调通过沉默lnc-HZ08在两种滋养细胞中都被削弱了（图2b）。总之，这些结果表明，lnc-HZ08下调了人类滋养层细胞中的PI3K/p-AKT/p-P21/CDK2信号传导途径。
为了进一步探讨lnc-HZ08是否通过该PI3K/p-AKT/p-P21/CDK2途径调节滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭，用740 Y-P或LY294002处理滋养层细胞，并测定细胞的音型。细胞增殖、迁移和侵袭被740 Y-P促进，它激活了PI3K/pAKT/p-P21/CDK2途径（图2c, 2d）。然而，这种促进作用因过量表达lnc-HZ08而减弱（图2c, 2d）。同样，LY294002抑制了增殖、迁移和侵袭，它下调了p-AKT/p-P21/CDK2信号通路（图2e, 2f）。同样，在这两个细胞中沉默lnc-HZ08后，这种下调被削弱了（图2e，2f）。所有这些结果验证了lnc-HZ08可能通过下调PI3K/p-AKT/P21/CDK2途径抑制增殖、迁移和侵袭。
Fig. 3 Lnc-HZ08 promotes PI3K ubiquitin degradation by enhancing the interactions between PI3K and CBL in human trophoblast cells.
在已知lnc-HZ08抑制PI3K/pAKT/p-p21/CDK2通路后，研究lnc-HZ08在该通路上游PI3K调控中的作用。研究发现，lnc-HZ08过表达或敲低在mRNA水平上并不影响PI3K和AKT。随后，我们探讨lnc-HZ08是否影响PI3K蛋白的稳定性。Lnc-HZ08过表达降低了PI3K蛋白的稳定性，而Lnc-HZ08沉默增强了PI3K蛋白的稳定性(图3a)。据报道，蛋白质泛素化是真核细胞中促进蛋白质降解的主要途径之一。然后检测lnc-HZ08对PI3K泛素化(即PI3K- Ub的形成)的影响。Lnc-HZ08过表达增加，而Lnc-HZ08沉默降低，PI3K-Ub水平升高(图3b)，表明Lnc-HZ08可能促进人滋养层细胞中PI3K的泛素化和降解。研究发现CBL是外周T细胞中PI3K的E3泛素连接酶。然后，在滋养细胞中过表达或沉默CBL，通过RT-qPCR和Western blotting分析验证转染效率。CBL过表达促进了PI3K在两种滋养细胞中的泛素化，而CBL沉默则抑制了PI3K的泛素化。然而，lncHZ08过表达或敲低并不影响CBL的mRNA或蛋白水平。在IP试验中，我们发现滋养层细胞中的PI3K可以被CBL拉低(图3c)，CBL拉低的PI3K水平随着lnc-HZ08过表达而升高，随着lnc-HZ08敲低而降低(图3c)。同样，在滋养细胞中，CBL可以被PI3K拉低;PI3K拉低的CBL水平随着lnc-HZ08过表达而升高，随着lnc-HZ08沉默而降低。这些结果表明，lnc-HZ08可能不会影响人滋养层细胞中CBL蛋白的水平，但会增强了其与PI3K的结合。
为了探索它们之间潜在的相互作用，我们进行了RIP实验，发现在Swan 71和HTR-8/SV neo细胞中，lnc-HZ08可以被CBL或PI3K蛋白拉下，这意味着lnc-HZ08可能与CBL和PI3K蛋白都相互作用(图3d)。为了确定lnc-HZ08的相互作用区域，我们将lnc-HZ08分成4个片段，每个片段包含200 nt(图3e)。在使用lnc-HZ08片段的PI3K RIP检测中，lnc-HZ08中可能与PI3K相互作用的区域被PI3K保护，不被RNase i降解。RT-qPCR鉴定lnc-HZ08中的区域为201-400 nt(图3f)。同样，在CBL RIP检测中，lnc-HZ08中可以与CBL相互作用的区域为1-200 nt(图3 f)。这些结果表明，PI3K和CBL蛋白结合在lnc-HZ08中两个不同的区域。此外，RNA下拉试验显示，CBL和PI3K蛋白都可以被生物素标记的全长lnc-HZ08在滋养层细胞中下拉(图3g)。此外，PI3K蛋白也可以被生物素标记的lnc-HZ08 201 - 400nt片段拉低，CBL蛋白也可以被生物素标记的1-200nt片段拉低(图3g)。这些结果进一步证实了PI3K和CBL蛋白可能与lnc-HZ08中两个不同的区域结合。
为了进一步验证lnc-HZ08可能增强CBL和PI3K之间的结合，我们用过量表达全长或截短的lnc-HZ08的细胞进行IP试验。过量表达全长的lncHZ08而不是其片段，增加了被CBL拉下的PI3K的水平（图3h），这意味着全长的lnc-HZ08对于增强它们的蛋白质相互作用是必不可少的。我们还进行了IP实验来确定PI3K泛素化。我们发现，过量表达全长的lnc-HZ08而不是其片段会增加PI3K-Ub的水平，并减少PI3K的总水平。
鸣谢：Jiayu Xie, et al.Cell Biol Toxicol. 2022 Apr;38(2):291-310.
