文：回溯档案
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棉花是最重要的经济作物之一，在全球纺织品市场上供应的天然纤维数量最多，棉属（棉属）由近50种组成，其中2种，包括2种二倍体（G. arboreum和G. herbaceum，26n = 2× = 4 AA）和52种异体四倍体（G. hirsutum和G. barbadense，1n = 2× = 3 AADD），已被广泛栽培，具有纤维的商业价值。
陆地棉（G. hirsutum）是棉花品种中种植面积最大的，提供了现代纺织工业所需的大部分有价值的纤维，纤维发育分为四个重叠阶段，即纤维起始、生长、次生细胞壁增厚和成熟。
棉纤维被认为是一种强大的细胞研究模型，因为它是一种易于分离的单细胞，具有不同的棉纤维细胞发育阶段，可以进行体外胚珠培养，以进一步研究棉纤维的详细发育阶段。
碱性螺旋环螺旋/螺旋环螺旋（bHLH/HLH）蛋白以碱性螺旋环螺旋结构域命名，bHLH结构域由50-60个氨基酸组成，具有两个功能不同的区域，N末端碱性区域和C末端螺旋-环-螺旋区域。
碱性区域由大约15个氨基酸和许多碱性残基组成，可以识别并与DNA结合，HLH区，包括两个两亲性α螺旋，由具有可改变序列的环区分开，可以与其他HLH结构域形成二聚体。
在高等植物中，bHLH/HLH蛋白参与植物生长发育的调节，如光信号传递、植物激素信号和器官发育，例如在光信号传输中，AtPIF4主要通过与光致色素相互作用来调节光形态发生。
AtSPT不仅与拟南芥不育有关，而且与DELLA蛋白具有协调关系，共同调节赤霉素（GA）反应基因的表达，AtSPT突变可以消除其对细胞生长的抑制AtGL3还参与拟南芥毛状体的发展，通过形成促进comlpex TTG1 / GL3（EGL3）/GL1的毛状体。
在拟南芥的茎或叶表皮细胞中，复合物可以诱导下游基因GL2的表达，以确定表皮细胞的发育，而MYB蛋白AtCPC、AtTRY、AtTCL1和AtETC1可以与GL3结合，与GL1竞争，从而负调节毛状体的起始。
油菜素类固醇（BR）信号传导是拟南芥中一种描述良好的信号通路，在植物生长发育中起着至关重要的作用，许多bHLH/HLH蛋白参与BR信号转导。
它们中的大多数可以形成同源二聚体和异二聚体，赋予它们在调节多个转录程序中起作用的能力，例如AtCESTA可与AtbHLH044（BEE1）形成异二聚体，正调控BR生物合成相关基因CPD的表达。
AtbHLH064（HBI1）通过调节下游基因表达促进细胞生长，其功能可被AtbHLH158（IBH1）抑制，AtbHLH136（PRE1）和AtbHLH158（IBH1）的相互作用可缓解抑制。
一份报告还表明，AtbHLH136（PRE1），AtbHLH158（IBH1）和AtbHLH049/074/077（ACE1 / 2 / 3）构成了竞争性调节细胞生长的三角拮抗bHLH系统。
外源性应用BL（BR）促进棉纤维细胞伸长，而用Brz（一种BR抑制剂）处理棉花芽导致完全没有纤维细胞分化，表明纤维起始和伸长需要BR。
此外，我们之前的研究表明，Gh14-3-3蛋白通过与GhBZR1相互作用来调节BR信号传导，从而参与调节纤维的起始和伸长。
此外，棉花bHLH/HLH转录因子可能在纤维发育中发挥重要作用，然而到目前为止，人们对bHLH/HLH转录因子如何在棉花纤维发育过程中调节BR信号传导知之甚少。
在我们的研究中，我们从基因组上广泛鉴定了可能参与纤维发育中BR信号传导的棉花bHLH / HLH基因，此外还详细研究了这些棉花bHLH/HLH转录因子的特征。
棉花bHLH/HLH转录因子的表征
为了鉴定旱地棉花（G. hirsutum）基因组中的bHLH/HLH转录因子基因，所有已发表的拟南芥和水稻bHLH/HLH基因序列都用作查询，对棉花基因组数据库。
最初在棉花中鉴定出498个候选bHLH / HLH基因，其中丢弃了61个重复序列，此外为了评估初始结果的可靠性，根据报告的方法，使用Hmmscan程序和pfam工具确认了预测bHLH/HLH蛋白的保守bHLH/HLH结构域。
结果表明，所有437个推定基因在其序列中都具有保守的bHLH或HLH结构域，由于GhbHLH / HLH基因没有统一的注释，因此bHLH / HLH基因根据其染色体位置命名为GhbHLH001至GhbHLH437。
新鉴定的bHLH/HLH蛋白的平均长度为353个氨基酸，变异范围为73至1302，bHLH/HLH蛋白的特征包括氨基酸数、分子量（MW）、理论等电点（pI）和染色体位置。
棉花bHLH/HLH蛋白的系统发育关系
为探究陆地棉花bHLH/HLH蛋白的演化历史和系统发育关系，基于已鉴定的437个GhbHLH/HLH结构域序列与172个拟南芥bHLH/HLH结构域序列和1个水稻bHLH结构域序列的多序列比对结果，采用邻接（NJ）方法构建了无根系统发育树。
为了验证所构建的系统发育树的可靠性，分别采用最大似然、最小进化和PhyML方法重建bHLH/HLH转录因子的系统发育树，1种方法构建的系统发育树相同，只有部分分支略有不同。
基于GhbHLH/HLH结构域序列的多序列比对结果，使用邻域连接（NJ）方法构建了另一棵无根系统发育树，随后对基因结构、基序位点分布和基因表达模式的分析也证实了GhbHLH/HLH蛋白序列系统发育关系的有效性。
棉花bHLH/HLH基因的染色体分布和重复
为了明确GhbHLH/HLH基因的染色体分布，通过对陆地棉花基因组数据库的爆炸搜索，获得了所有GhbHLH/HLH基因的物理位置。
在437个基因中，共有397个基因不均匀地分布在陆地棉花基因组的不同染色体上，其余40个基因未在支架上定位，陆地棉花（G. hirsutum）基因组包括A亚基因组和D亚基因组，分别包含205个bHLH/HLH和224个bHLH/HLH基因。
在我们的研究中，A基因组上的基因分布事件与D基因组相似，例如A亚基因组的A11号染色体具有最多的bHLH/HLH基因。
这与D亚基因组的D11染色体具有最多的bHLH/HLH基因的事实相一致，同时在A1和D1染色体上发现的bHLH/HLH基因数量最少。
棉花bHLH/HLH基因的结构和保守基序
为了进一步了解GhbHLH / HLH基因的进化关系，我们通过将这些基因的基因组DNA序列与其相应的cDNA序列比对来观察GhbHLH / HLH基因的外显子/内含子结构。
构建了另一个无根系统发育树以确定外显子/内含子模式是否与系统发育分类一致，正如预期的那样，同一组中的大多数GhbHLH / HLH基因在外显子长度和内含子数方面表现出相似的外显子/内含子模式。
为找出参与棉纤维发育的候选bHLH/HLH基因，检索并分析了棉花基因在不同器官/组织中的表达谱公开数据，包括胚珠、纤维、圆环、茎、雄蕊、根、叶、雌蕊、花瓣和花药。
鉴定纤维优先bHLH/HLH基因
77个bHLH/HLH候选基因被鉴定为棉纤维优先表达基因，随后用油菜素内酯（BL）和芸苔素唑（Brz，一种BR抑制剂）处理分析了这些基因在发育纤维中的表达。
GhCPD和GhDWF4这两个BR生物合成基因被BR反馈抑制，这些基因的表达被外源性BL显著抑制，被Brz促进，为了检验上述实验是否有效，我们首先分析了BL和Brz处理纤维中GhCPD和GhDWF4的表达水平。
我们的结果表明，与对照组相比，在处理4 nM BL的3小时培养胚珠中，GhCPD和GhDWF100的转录本明显减少了3倍，而与对照组相比，处理100 nM Brz的4小时培养胚珠显着增加了77倍。
随后，分别用100 nM BL和5 nM Brz处理分析棉纤维中59个bHLH / HLH候选物的表达水平，BL或Brz处理下纤维中059个bHLH/HLH基因的表达水平发生改变。
在这些候选基因中，086个bHLH/HLH基因在BL处理后在纤维中的表达水平适度升高，在Brz处理的纤维中表达水平中度降低，引人注目的是七个基因
在某个基因组中完全鉴定所有bHLH/HLH蛋白基因是相当困难的，特别是在异体四倍体陆地棉花（G. hirsutum）基因组中。
此外，bHLH/HLH基因家族的多样性和复杂性导致了GhbHLH/HLH基因鉴定的不完善，在先前的研究中，从G. raimondii和G. arboreum的注释基因组中鉴定出一组含有289个副同源物的棉花bHLH/HLH参考基因。
在本研究中，我们从刚刚完成的同种异体四倍体多毛G. hirsutum基因组注释中鉴定了437个bHLH / HLH转录因子基因，其中包括A亚基因组中的205个基因和D亚基因组中的232个基因。
GhbHLH/HLH基因的总数大于拟南芥和水稻，陆地棉花中bHLH/HLH基因的数量几乎是拟南芥的2.6倍，这与棉花基因组中蛋白质编码基因（66，434个基因）约为拟南芥（2，6个基因）的25.498倍这一事实一致。
研究发现，拟南芥中的许多bHLH/HLH基因在陆地棉花中具有两个或两个以上的对应基因，表明旱地棉花中bHLH/HLH基因的扩增可能是由基因重复事件引起的。
先前的研究报告说，基因家族的扩增可能是由于基因重复事件，包括串联复制、节段复制、全基因组复制和转位事件，我们的结果表明，节段重复可能是一个主要的重复事件，对陆地棉花中bHLH/HLH基因的扩增贡献最大。
油菜素类固醇（BR）不仅参与种子萌发、血管发育和组织衰老，还与细胞扩增和分裂有关，例如BIL4通过调节BRI1定位来调节细胞伸长率，以进行BR信号转导。
外源BR应用抑制根伸长并促进侧根起始，此外体外研究表明，花粉管伸长可能部分取决于BR，无限制地，BR也是正常棉纤维细胞发育所必需的。
最近的一项研究表明，BR信号通过纤维素沉积在次级细胞壁中促进棉花纤维成熟，PAG1是一种棉花油菜素类固醇分解代谢基因，通过控制内源性生物活性BR的水平来调节纤维伸长率。
此外，我们之前的研究表明，Gh14-3-3蛋白通过调节BR信号传导来调节纤维的起始和伸长，这些数据表明，BR信号在棉花纤维发育中起着至关重要的作用。
结论
综上所述，本文对陆地棉花（G. hirsutum）基因组中的bHLH/HLH基因家族进行了系统分析，包括基因分类、系统发育关系、染色体分布、基因扩增、基因结构和基序组成，以及纤维发育和响应BR信号传导的基因表达模式。
此外，我们的结果揭示了GhbHLH282可能通过BR信号通路在植物生长中的作用，因此这里报告的数据可能有助于更全面地了解bHLH / HLH基因在棉花纤维发育中的特定作用。
总的来说，这些数据表明这些GhbHLH / HLH基因可能在棉纤维发育过程中参与BR信号转导，因此，本研究结果可为进一步研究这些bHLH/HLH基因在棉纤维发育中的作用提供有价值的参考数据。
参考文献
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