AbMole精研抑制剂十年，最新的科研动态不断与您分享。本期与您分享的是: 肠病毒-71利用小细胞外囊泡穿过血脑屏障，通过胞吞感染中枢神经系统。

背景:肠病毒71型(EV71)引起的中枢神经系统(CNS)感染对儿童构成严重威胁，部分患者可引起严重的神经源性并发症甚至死亡。然而，EV71感染中枢神经系统的发病机制尚不清楚。

方法:采用脑微血管内皮细胞(BMECs)和星形胶质细胞共培养的方法构建体外血脑屏障(BBB)模型，模拟中枢神经系统感染。通过密度梯度离心法从细胞培养上清中分离出EV71感染细胞(EV71‐sEVs)中的EV71病毒粒子和胞外小泡(sEVs)。血脑屏障模型分别用EV71病毒粒子和EV71‐sEVs感染。通过抑制不同的内吞方式确定了血脑屏障的交叉机制。为了验证体外实验结果，建立了小鼠EV71感染模型。结果:含有病毒成分的EV71‐sEVs被BMECs内吞并释放到血脑屏障模型的外腔侧，在感染早期不破坏血脑屏障的情况下感染星形胶质细胞。在感染后期，通过下调PI3K/Akt信号通路，BMECs之间紧密连接(TJs)的完整性被破坏。结论:EV71利用循环的sEVs通过血脑屏障感染中枢神经系统。

Amiloride (Abmole，M3386，纯度> 98%)是一种吡嗪化合物，通过抑制肾小管上皮细胞的钠离子通道，而抑制钠的重吸收。Dynasore (Abmole，M2569，纯度> 99%)是一种可渗透细胞的，可逆的，非竞争性的dynamin（发动蛋白）抑制剂，抑制dynamin 1/2的GTPase活性，IC50为15 μM，也抑制线粒体dynamin Drp1，对其他小GTP酶没有作用效果。Chlorpromazine (Abmole，M20535，纯度>99%)是一种典型的低效抗精神病药，用于治疗精神分裂症等精神障碍。Nystatin (Abmole，M3290，纯度>4400u/mg)是一种多烯类抗真菌剂，对许多霉菌和酵母菌是敏感的，包括Candida spp。

FIGURE 3. EV71‐sEVs crossed the brain endothelium via micropinocytosis.

由于sEVs介导的内吞作用是一种典型的跨细胞途径，我们推测EV71可能利用sEVs作为与BMECs结合后通过内吞作用穿过血脑屏障的载体。用内吞抑制剂Dynasore预处理BMECs，可显著减少sEVs的摄取，但对EV71病毒粒子无影响(图3A,B)。Dynasore对EV71‐sEVs和Mock‐sEVs具有相同的抑制作用(图3C,D)。这些结果表明，sEVs能够通过内吞作用通过脑内皮，而病毒粒子不能通过脑内皮。为了确定sEVs内吞作用的具体机制，将BMECs分别用转铁蛋白(网格蛋白依赖性内吞作用的标记物)和70 kDa的葡聚糖(大胞饮作用的标记物)和用DiD荧光染料标记的EV71‐sEVs处理。荧光显微镜分析显示EV71‐sEVs部分与小腔蛋白1、转铁蛋白和70 kDa的葡聚糖共定位，表明EV71‐sEVs进入BMECs的胞吞是由小腔蛋白依赖性内吞、网格蛋白依赖性内吞和大胞细胞介导的(图3E)。

为了确定对EV71‐sEVs的胞吞作用最重要的途径，用不同内吞途径的抑制剂预处理BMECs，随后用流式细胞术检测DiD标记的EV71‐sEVs的摄取。当然，CCK8检测显示，这些抑制剂的浓度对BMECs没有细胞毒性(图3F)。Chlorpromazine (一种网格蛋白依赖性内吞作用的抑制剂)、Amiloride (一种大胞饮作用的抑制剂)和Nystatin (一种小腔蛋白依赖性内吞作用的抑制剂)都能减少EV71‐sEVs的摄取。显然，使用阿米洛利治疗后，EV71‐sEVs的吸收明显减少(图3G)。总之，结果表明，EV71‐sEVs通过脑内皮的主要途径是大型胞饮作用。

鸣谢：Jiaqi Gu, et al. J Med Virol. 2022 Sep 2.