作者：桂林市第三人民医院 程书权教授
编者按
乙肝检测非常重要，因为在感染早期甚至此后相当长的阶段，乙型肝炎病毒（HBV）感染者没有任何临床表现。桂林市第三人民医院程书权教授理了国内外新兴检测方法与理念的相关报道，总结其在慢性乙型肝炎（CHB）功能性治愈评估中的应用希望对临床有所裨益。本篇首先介绍HBV大表面蛋白（LHBs）、中表面蛋白（MHBs）、小表面蛋白（SHBs）检测及其临床意义。
目前，随着抗HBV新治疗方法和技术的不断涌现，广大接受口服核苷（酸）类似物（NAs）长期治疗的CHB患者追求功能性治愈的意愿越来越迫切。迄今为止，相关研究和探讨已逐渐明确用于功能性治愈的药物品种、剂型、疗程、应用方案和最适宜群体，并将其写入国内外的CHB防治指南或专家共识。
“工欲善其事，必先利其器”，临床发现，在评价功能性治愈过程中需要依据敏感而精确的检验指标，对不同特征的患者进行评价和指导，以规范准确用药并及时优化治疗方案。可惜最切合临床实践的检测手段与技术依然欠缺。因此，临床对新的适宜评价技术手段的呼吁与期待从未停歇。
常规方法的应用与不足[1]
近年来，临床用于CHB筛查、确诊、抗病毒治疗指征把控、药物遴选、疗效评估和预后判断等过程的常用辅助检查可以用“老四样”来概括：其中检测项目为肝功能、乙肝五项、HBV DNA和肝纤四项；影像学主要有腹部彩超、肝脏CT、肝脏核磁共振、肝脏瞬时弹性成像检查四项。
多年以来，这些方法对CHB的诊断、治疗及预后的评判一直发挥着不可或缺的作用。但在CHB确诊后，尤其是应用NAs治疗达到初期控制目标或进一步追求功能性治愈的阶段，在进一步的细化与病情推演方面，其灵敏性和评估预测价值则力有不逮。
例如HBeAg阴性的“小三阳”CHB，多数患者往往通过2~3个月的抗HBV治疗，肝功能即可完全恢复正常，HBV DNA亦可低于检测值，肝脏的炎症活动停止，也没有了对他人的传染性，即显示出较好的临床应答疗效。观察乙肝五项检查则持续保持在“小三阳”的状态，偏高的肝纤四项或肝脏的硬度亦很快恢复至正常范围。但此后再复查上述指标，可能多年都一成不变，有的甚至历经十年八载的漫长时段，与初治时的结果相比还是难以看到进一步的改变，即便每次都做彩超甚至肝脏CT等影像学检查，但报告可能依然为和治疗前期相似的“肝脏回声增粗、光点致密”等非特异性的雷同描述，无法对其能否停药进行预判、甄别，令长期服药的患者看不到一丝被治愈的曙光，这对治疗依从性十分不利。
虽然有时定量检测HBsAg可发现指标的明显下降，对治疗评估有助，但倘若进入平台期，其数值一直在较低的水平波动徘徊，便不能再为下一步的治疗提供指导。
HBV LHBs 、MHBs、SHBs的检测[1-3]
在自然条件下，HBV在冷冻电镜下为直径约52 nm的球状颗粒，其外膜由3种外膜蛋白——LHB、MHB、SHB和不同脂类组成，包裹20面体核衣壳核心。
除病毒体外，被感染的肝细胞也分泌HBV表面蛋白的球状颗粒（直径为20 nm）和丝状颗粒。在高病毒血症患者的血清中，表面蛋白颗粒数量一般较病毒体多1000~10 000倍。由于这些颗粒不含病毒DNA，因此无传染性，只形成抗原血症。
3种HBV表面蛋白均在一个开放读码框（ORF）内，由框内启动子编码，由2个不同的mRNA翻译：一个2.4 kb mRNA翻译LHBs，另一个2.1 kb mRNA翻译MHBs，并各自由特异的启动子区转录，通过对蛋白表达的不同调节合成大、中、小3种表面蛋白。
LHBs含受体结合域，为HBV感染肝细胞所必需，应用NAs治疗时，随着HBV的下降，LHBs也减少；MHBs对HBV复制不起主要作用，在HBeAg阳性患者中可检测到，但在HBeAg阴性患者中很少检测到，表明MHBs与HBeAg表达相关；SHBs主要在HBV亚单位颗粒上，故NAs治疗不导致SHBs减少。目前应用ELISA法检测血清LHBs和MHBs，SHBs为间接计算获得，即总HBsAg量减去LHBs和MHBs量。
检测LHBs、MHBs和SHBs水平的临床意义[2,3]
01
与HBV基因型有关[1]
一项德国的研究通过对一组HBeAg阴性（HBV DNA＜100 000IU/mL、ALT＜2倍正常值上限）的A~E基因型CHB的LHBs、MHBs和SHBs组成进行比较发现，除B基因型LHBs比例高于MHBs外，A、C、D、E基因型MHBs比例均高于LHBs；B基因型LHBs比例高于其他基因型，而B基因型CHB对功能性治愈的主要药物干扰素的治疗应答明显优于C型。
国外另外一项研究通过检测127例亚洲HBeAg阳性CHB者的血清乙肝表面蛋白发现，在聚乙二醇干扰素（PEG-IFN）α-2a治疗前和治疗期间，在所有时间点，有持续应答者（治疗后24周发生HBeAg血清转换）的平均总表面蛋白水平明显低于无反应者（P＜0.05），且在最初24周的治疗期间稳步下降（有反应者和无反应者分别下降1.16 ng/mL和0.86 ng/mL）。B基因型的LHBs比例是C基因型的两倍（13%和6%），显示不同HBV基因类型的乙肝表面蛋白水平存在差异。研究者认为表面蛋白水平同样可以很好地预测治疗应答反应，尤其是B基因型CHB患者，其价值不逊色于HBV DNA、HBeAg、HBsAg，协同检测可能互补价值更大。
02
LHBs和MHBs消失可预测急性乙型肝炎康复[4-8]
国外曾经对20例急性乙型肝炎动态检测总HBsAg、LHBs和MHBs，其中16例检测到LHBs，15例检测到MHBs。其中，1例首份血清标本LHBs阳性但MHBs阴性患者，于发病后1周内HBeAg和总HBsAg均消失；50%的患者于发病后1周内MHBs阴转，50%的患者于发病后4周内LHBs阴转，所有MHBs和LHBs转阴患者总HBsAg均消失，表明为自限性急性乙型肝炎。对1例无并发症急性乙型肝炎患者的系列血清标本动态检测HBV DNA、HBeAg、抗-HBe、LHBs、MHBs和总HBsAg，显示发病第1天即可检测到HBV DNA、HBeAg、LHBs、MHBs和总HBsAg。MHBs和LHBs先后于病后第3周和第4周转阴，于第4周HBV DNA检测不到，第18周总HBsAg清除。因此，MHBs和LHBs消失可预测CHB的康复情况，并且相较于LHBs，MHBs可更早预测HBsAg清除。
03
LHBs和MHBs可预测CHB患者HBsAg的消失情况[2]
HBsAg是病毒复制的关键血清标志物，HBsAg清除被认为是病情稳定与缓解的标志，可通过抗HBV治疗实现。
国外一项回顾性研究分析不同治疗过程中HBsAg的LHBs、MHBs的动态变化发现，64例CHB患者中有17例在NAs治疗期间实现HBsAg清除，3例在接受PEG-IFN治疗48周后实现HBsAg清除。63例未实现HBsAg清除的患者作为对照。在治疗前和治疗期间对血清中LHBs、MHBs和SHBs进行定量分析。
治疗前，HBsAg清除者的中位MHBs水平明显低于未清除者（P=0.005）。治疗期间，HBsAg清除者的MHBs和LHBs比例迅速下降，但未发生HBeAg血清转换者或无血清学应答者无改变。在所有HBsAg清除者中，MHBs在NAs治疗第6个月时均无法检测到，平均发生在HBsAg完全清除前12.8±8.7个月。研究者认为MHBs演变是应用NAs治疗前推演HBsAg清除的最佳早期预测因子。在使用PEG-IFN实现HBsAg清除者中，MHBs和LHBs亦表现出类似的状况。
研究认为HBsAg蛋白定量有望成为预测早期治疗反应的新工具，以此评估有助于优化个体抗病毒治疗，提高CHB患者的功能性治愈率。在HBsAg清除之前，LHBs和MHBs比HBsAg下降更早，是预测CHB功能性治愈的新型生物标志物候选者。
另一项研究纳入41例经恩替卡韦治疗和21例经PEG-IFN治疗的HBeAg阳性CHB患者，于基线和抗病毒治疗后4、12、24、36和48周定量检测LHBs、HBsAg和HBV DNA。结果发现血清LHBs水平与HBV DNA和HBsAg呈正相关。两组患者血清LHBs和HBV DNA水平下降显著，但HBsAg下降缓慢；PEG-IFN组于治疗第4周血清LHBs为88.46 ng/mL的病毒学应答的阳性和阴性预示值分别为88.9%和100%，优于预测恩替卡韦治疗应答；联合LHBs、总HBsAg和HBV DNA可更好地预测病毒学和血清学应答。
04
治疗过程中MHBs升高可能与肝细胞癌（HCC）有关[3,4]
研究发现，LHBs、MHBs和SHBs有助于HBV驱动的促癌特性。国外对30例乙肝肝硬化者随访38（12~48）个月，其中13例发生HCC。发生HCC患者与未发生HCC患者，在入组时（T0）和HCC诊断时或非HCC患者的最后一次对照时采集血清样本，随访12~48个月。观察LHBs、MHBs和SHBs。在T0时，SHBs、MHBs和LHBs的中值（IQR）水平分别为3140、220和0.2 ng/mL。在T0时患或未患HCC的患者中，SHBs、MHBs和LHBs的比例无显著差异。
治疗中，HCC和非HCC者中SHBs下降＞25%或保持稳定的比例相似。相反，HCC患者中MHBs增加＞25%的比例高于非HCC患者，分别为50%vs. 11.8%（P=0.02），HCC患者和非HCC患者的LHBs动力学无差异。与体外研究报告的MHBs促癌作用一致。总之，在长期HBV抑制和总HBs稳定或降低的情况下，很大一部分HCC患者的MHBs水平升高。因此，MHBs的动态检测在识别高HCC风险患者中的作用值得进一步关注。
在血清中不能检测到HBsAg并不代表关闭了HBsAg的产生，因为循环的HBsAg可能与抗-HBs以复合物的形式存在。HBV产生空白包膜颗粒，其病毒粒子数可能超过1 000倍。因此检测病毒体中的大、中、小表面蛋白等亚病毒颗粒，有益于加以区分与鉴别。
囿于目前关于LHBs、MHBs和SHBs的临床研究均为小样本报告，其确切意义的进一步研究值得关注。
参考文献：
1.Rinker F, Bremer CM, SchrÖder K, et al. Quantitation of large, middle and small hepatitis B surface proteins in HBeAg-positive patients treated with peginterferon alfa-2a.Liver Int, 2020,40(2):324-332.DOI:10.1111/liv.14298.
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4.Peiffer KH,Kuhnhenn L,Jiang B,et al.Divergent preS Sequences in Virion-Associated Hepatitis B Virus Genomes and Subviral HBV Surface Antigen Particles From HBV e Antigen-Negative Patients.J Infect Dis.2018;218(1):114-123.
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6.Lazarevic I,Miljanovic D,Banko A,et al.Quantitative HBV Core Antibodies as a Prognostic Marker for HBeAg Seroclearance: A Systematic Review with Meta-Analysis.Viruses.2024;16(7):1121.
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8.Pfefferkorn M, van Bömmel F. Commentary: Serum hepatitis B virus large and medium surface proteins as novel tools for predicting HBsAg clearance.Front Immunol.2022 Dec 2;13:1081730.
