文：回溯档案

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番茄黄化曲叶病(TYLCD)是感染番茄的最重要的病毒性疾病之一，在全世界范围内造成严重的经济损失。

感染黄曲叶病毒的番茄会出现叶缘黄化和卷叶症状，从而导致产量损失和市场价值降低，该病害主要由黄化曲叶病毒引起，1964年第一次出现在以色列报道中，随后于1990年代在美国佛罗里达州、佐治亚州和路易斯安那州等多个州发现。

抗 TYLCV 单克隆抗体的生产和表征

将纯化的 TYLCV 病毒体作为免疫原注射到 6 只 BALB/c 小鼠中，第4次免疫后，取出免疫小鼠的脾细胞用于制备杂交瘤，通过细胞融合、细胞培养、抗体检测和细胞克隆，获得6个分泌抗TYLCV单克隆抗体的杂交瘤细胞系，并将其腹腔注射到原始引发的BALB/c小鼠体内产生腹水。

四种MAb的免疫球蛋白类别和亚类被同种型为IgG1，而另外两种MAb被同种型为IgG2a，六种 MAb 的轻链均为 kappa 轻链类型，腹水中单克隆抗体的 IgG 产量范围为 2.01 至 9.23 mg mL -1，通过间接ELISA测定的腹水中六种MAb的效价范围为10 -6至10 -7。

六种 MAb 与八种 Begomovirus 的反应：TYLCV、木瓜卷叶中国病毒 、臭木瓜金花叶中国病毒、藿香黄脉中国病毒、番茄卷叶台湾病毒 、烟草卷叶病毒病毒，番茄黄曲叶中国病毒和锦葵黄脉病毒通过三抗体夹心酶联免疫吸附测定进行测定。

还通过 ACP-ELISA 分析了 MAb 1C4 检测 TYLCV 的敏感性。将 TYLCV 感染的植物组织的粗提物从 1:10 连续两倍稀释至 1:40,960，分析结果表明，MAb 1C4可以检测1:10,240稀释的感染植物组织粗提物中的TYLCV，因此MAb 1C4 对 TYLCV 检测高度敏感。

用于番茄植株 TYLCV 检测的 DTBIA

MAb 1C4 和与碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠 IgG 的工作稀释度通过方阵测试确定，三个独立 DTBIA 的结果表明，当 MAb 和与 AP 缀合的IgG 分别以 1:5,000 和 1:8,000 的稀释度使用时，很容易在受感染的植物组织中检测到 TYLCV。

用于植物样品中 TYLCV 检测的点 ELISA

三个独立方阵测试的结果表明，当 MAb 和与 AP (Sigma-Aldrich) 缀合的山羊抗小鼠 IgG 以 1:5,000 的稀释度使用时，通过点 ELISA 很容易在受感染的植物组织中检测到 TYLCV。

使用 TYLCV 感染的番茄植物的 PBS 连续两倍稀释来确定斑点 ELISA 的灵敏度，结果表明，dot-ELISA可以检测到1:5120稀释的感染组织粗提物中的TYLCV，这表明该测定对于番茄植株样品中的 TYLCV 检测高度敏感。

用于现场粉虱样本中 TYLCV 检测的点 ELISA

三个独立方阵测试的结果表明，MAb 1C4 的 1:3,000 稀释度和与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠 IgG 的 1:5,000 稀释度最适合 dot-ELISA 检测粉虱样本中的 TYLCV，在此最佳条件下，dot-ELISA 可以检测以 1:128稀释的个体粉虱匀浆中的 TYLCV。

在110只粉虱中，有39个样品经ELISA检测呈阳性，斑点ELISA，所有这些粉虱样本同时进行PCR和核苷酸测序分析，PCR检测和核苷酸测序结果与dot-ELISA结果一致，这证实了所开发的点 ELISA 是仅从 TYLCV 流行地区收集的粉虱载体中检测 TYLCV 的有效方法。

通过 DTBIA 和 dot-ELISA 检测田间植物样品

使用开发的 dot-ELISA 和 DTBIA，对来自 TYL?CV 流行的 487 个表现出病毒样症状的田间番茄样本进行了 TYLCV 的筛查，结果显示487 个番茄样品中有 233 个通过 dot-ELISA 和 DTBIA 检测呈阳性。

使用简并引物对 PA/PB 通过 PCR 进一步检测所有 487 个田间番茄植株样品中的 TYLCV，并对PCR产物进行克隆和测序，将分离株的扩增核苷酸序列与GenBank中的TYLCV序列进行比对，扩增产物与GenBank中的TYLCV序列同源性达到97.6%以上。

PCR和核苷酸测序结果进一步证实了dot-ELISA和DTBIA的检测结果，表明dot-ELISA和DTBIA可用于检测从流行区收集的田间番茄植株中的TYLCV。

60多个MAb

基于这一结果和 Begomovirus 外壳蛋白氨基酸序列的保守性，我们假设很难产生 TYLCV 特异性抗体，不过，我们将进一步制备TYLCV特异性单克隆抗体，用于TYLCV的特异性检测，目前田间番茄植株仅感染TYLCV，而其他等地田间番茄植株被TYLCV感染。

有 TYLCV、TYLCTHV、TYLCCNV、ToLCCNV、ToLCGXV、ToLCYNV 和 PaLCuCNV 感染，虽然两者基于MAb 1C4开发的血清学检测方法不仅可以检测TYLCV，还可以检测TYLCTHV，对于感染番茄植株的LCTWV和PaLCuCNV。

目前，TYLCV和其他begomovirus主要通过PCR扩增来鉴定，该方法耗时、复杂、昂贵且依赖于仪器，本研究以纯化的 TYLCV 颗粒为免疫原制备了 6 种敏感的单克隆抗体，并成功开发了两种血清学方法，并将其应用于田间番茄植株和从 TYLCV 流行地区收集的粉虱载体中检测 TYLCV。

新开发的dot-ELISA可以检测1:5,120稀释的受感染番茄植物组织提取物中的，以及分别以 1:128 稀释的单个带病毒粉虱匀浆，据我们所知，这是第一个在番茄植株尤其是粉虱载体中使用 dot-ELISA 和 DTBIA 检测 TYLCV 的研究。

dot-ELISA 和 DTBIA 简单、快速、经济，对于田间植物和粉虱样品中 TYLCV 的高通量检测特别有吸引力，此外，dot-ELISA 和 DTBIA 的结果可以用肉眼轻松解读。

因此，这两种方法可作为常规诊断方法，研究我国TYLCV流行地区TYLCV的病原学和流行病学，对TYLCV检测技术的推广具有重要意义，此外，这两种TYLCV血清学检测方法的广泛应用，可以为我国TYLCV流行地区的TYLCD诊断、预测和科学防治提供服务。

植物和粉虱样本以及病毒来源

2012年，采集到出现病毒样症状的番茄植株，烟粉虱样品TYLCV感染的番茄田，并保存于95%乙醇中，以TYLCV感染的番茄植株和取食TYLCV感染的番茄植株的带毒粉虱作为阳性对照，以健康番茄植株和无毒粉虱作为阴性对照。

小鼠和动物实验

动物实验采用实验动物中心提供的雌性BALB/c小鼠，在动物科学研究中心进行中医学院，动物实验是根据赫尔辛基协议的原则进行的，实验方案经动物伦理委员会批准。

抗TYLCV单克隆抗体的制备

显微镜检查，使用先前描述的方案制备针对 TYLCV 的 MAb。TYLCV 颗粒是从 250 g 受TYLCV 感染性克隆农业接种的本塞姆氏烟草感染组织中纯化的，并用作免疫原，纯化的病毒粒子用2%磷钨酸染色，并用电子

用于植物和粉虱样品中 TYLCV 检测的点 ELISA

斑点 ELISA 程序是根据先前描述的方法进行的，稍作修改，简而言之，将植物样品用研钵和杵在 0.01 mol L -1中研磨磷酸盐缓冲盐水，然后在 5000×g 下离心 3 分钟。

将单个粉虱置于石蜡膜上的 2 μL PBS 中，并用 0.5 mL eppendorf 离心管底部研磨，将植物样品上清液和粉虱匀浆液分别点样到硝酸纤维素膜上，并在室温下风干10分钟。阴性和阳性对照分别用健康和TYLCV感染的植物组织的提取物或无毒和带毒粉虱的匀浆进行点样。

用5%脱脂奶封闭30分钟后，将膜在适当稀释的MAb中于37°C孵育1小时，用PBST洗涤四次后-1 PBS，将膜在适当稀释的山羊抗小鼠 IgG 中孵育，该山羊抗小鼠 IgG 与 AP或 HRP在 37°C 下再孵育 1 小时。最后，用 PBST 洗涤五次后，膜在 NBT/BCIP或 TMB中显色。

用于植物样品中 TYLCV 检测的 DTBIA

DTBIA 程序的操作如前所述，简而言之，用手术刀片横向切割受试植物的茎，并将横截面压在硝酸纤维素膜上 3-5 秒，阴性对照和阳性对照分别是健康植物和感染 TYLCV 的植物，将组织印迹在室温下风干 10 分钟，DTBIA后续步骤与dot-ELISA相同。

PCR 分析和测序

使用 CTAB 方法提取植物样品中的总 DNA， 简并引物对 PA 和 PB 用于扩增大约 500 bp 的片段，覆盖 DNA 的基因间区域 和 AV1 基因的一部分，使用自动化模型 3730 DNA 测序系统对扩增片段进行克隆和测序。

结语

利用杂交瘤技术，制备了6种抗TYLCV的鼠单克隆抗体，然后使用 MAb 1C4，建立了斑点 ELISA 和 DTBIA，用于检测TYLCV 流行省份采集的田间番茄和烟粉虱样本中的 TYLCV。

dot-ELISA可检测1:5,120，以及分别以 1:128 稀释的带毒粉虱匀浆，使用两种开发的方法对来自中国TYLCV流行区的田间番茄样本和烟粉虱样本进行TYLCV的筛查，并通过PCR和核苷酸测序进一步证实结果。

参考文献

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