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丝蛋白(Silk Protein)被列入国家863计划和国家自然科学基金项目的蚕丝蛋白生物医用材料研究工作取得重要突破。在不同类型的丝蛋白中，丝素蛋白(silk fibroin, SF)因其可及性、可加工性和可调的力学特性在生物材料研究中获得了显著的关注。甲基丙烯酰化丝素蛋白（Silk Fibroin Methacryloyl, SilMA）是较为常见的SF基改性材料之一，通过在SF分子上引入双键，使其具有光固化特性，具有良好的生物相容性、可生物降解性、高拉伸强度等特点，已被用于各种生物医学领域，包括伤口敷料、人造血管、细胞培养等。
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浙江大学杨明英、帅亚俊以及香港中文大学毛传斌团队以“Bioengineered Silk Protein-Based 3D In Vitro Models for Tissue Engineering and Drug Development: From Silk Matrix Properties to Biomedical Applications”为题在《Advanced Healthcare Materials》发表一篇综述。本综述考察了丝蛋白的组成、结构、性质和功能，阐明了它们在3D体外模型中的作用。其中也涉猎了诸多丝素蛋白基材料相关应用。
图1 通过化学交联策略，丝素蛋白(SF)发生了显著的溶液-凝胶转化
丝素蛋白是一种天然存在的聚合物，其用途已经超越了传统的界限，涵盖了食品保鲜、软电子、生物医学和环境可持续性等多个领域。丝素蛋白自身带有一些特性，这些特性使它们成为3D细胞培养研究的理想基质。
溶液-凝胶转变：丝素蛋白溶液是制造具有预定义形状的生物材料的中间阶段。原始的丝腺蛋白表现出在低剪切率下的近似牛顿流体特性，但在纺丝后会变为固体纤维。通过添加有机溶剂、pH调节、超声处理、化学交联和施加剪切效果，可以将丝素蛋白结构从无定形转变为结晶形，这对于定制丝基生物材料的形成和调节其物理化学特性至关重要。
机械特性：丝素蛋白基材料的机械特性可以通过生物矿化、有机-无机复合、有机溶剂铸造和微/纳米纤维增强等策略进行调节。例如，由六氟异丙醇（HFIP）衍生的支架具有较高的拉伸强度，而水衍生的支架则因其柔软的质地和较大的孔径而促进细胞粘附。
可降解性：丝素蛋白纤维以其长期稳定性而闻名，但再生丝素蛋白制备的生物材料可以具有可调节的生物降解速率，从几分钟到一年不等。丝素蛋白的可降解性对于细胞在丝素蛋白基质上的持续培养至关重要，可以满足细胞增殖和细胞外基质分泌的需求。
丝基质，它具有动态的机械特性，能够模拟细胞在生物体内所经历的复杂力学环境。这种基质可以为细胞提供一个更加接近生理状态的生长条件，从而在组织工程和生物医学研究中发挥重要作用。
图2 通过自组织的基于丝素蛋白（SF）的生物材料体外重建细胞外基质（ECM）样结构
丝素蛋白在模拟和替代天然ECM方面的巨大潜力，特别是在创建更接近体内条件的体外细胞培养模型方面。
细胞外基质(ECM)是一个由细胞分泌的胞外大分子构成的复杂三维框架，对组织成熟至关重要。然而，体外培养的细胞通常缺乏天然ECM中的复杂结构。为了解决这一问题，研究者们利用人工基质复制ECM中的生化和机械线索，其中丝素蛋白因其纯度高和类似天然ECM的功能而被视为有前景的ECM重塑候选材料。丝素蛋白基的组织等效物展现出均匀的细胞增殖和时空变化，表明它在某些情况下可以作为Matrigel的替代品。通过精确控制细胞-细胞相互作用、细胞-ECM接触和调控因子，丝素蛋白可以创建细胞基质微环境，促进细胞信号的协同调节，并通过多种工程策略，如电纺技术、3D生物打印、自组装和微图案化，来构建具有特定生化信号和生物物理线索的细胞-基质微环境。此外，3D生物打印技术的发展为创建复杂的3D结构和细胞培养提供了强大的工具，使得丝素蛋白基的3D培养模型能够更精确地模拟体内条件，从而革新了细胞的生长、扩散、功能和生物学结果。
图3 将蚕丝蛋白制成体外微组织模型的生物工程：功能和应用示意图
在生物医学研究中，三维空间动态模型（S3DMs）因其能够模拟体内环境而变得越来越重要，被用于开发包括类似骨组织、皮肤等效、胸腺生物工程、血脑屏障和牙周牙龈等多种类型的模型。这些模型利用丝素蛋白（SF）等材料，通过模拟细胞外基质的生化和物理特性，为药物筛选、疾病建模和组织工程提供了强大的实验平台。例如，3D肠道模型能够研究肠道微环境和宿主-微生物相互作用，而3D皮肤模型则能够评估皮肤屏障功能和治疗皮肤疾病的效果。这些模型不仅有助于解决动物实验的伦理问题，还提供了更符合人体生理特性的实验条件，从而推动了个性化医疗和精准医疗的发展。
图4 基于SF的体外肝脏模型及其特点
肝脏是人体第二大且最重要的内脏器官，承担着多种关键功能。面对脂肪肝病、药物或酒精引起的肝损伤以及肝细胞癌等肝脏疾病，研究人员已经开发出体外肝脏组织等效模型，这些模型能够模拟肝脏的生理功能和病理条件。例如，Abbott等人的研究表明，3%浓度的丝素多孔支架可以促进肝细胞长期生长并增加白蛋白表达，与2D培养相比，3D支架还能刺激与肝细胞脂肪变性相关的基因表达。此外，为了解决现有三维动态模型在复制肝细胞代谢异质性方面的局限性，另一项研究通过调整肝细胞外基质与丝素蛋白的比例，开发了一种体外肝脏系统，该系统在灌注生物反应器中培养，模拟了中心周围梯度效应和氧气梯度，为严重肝病患者提供了潜在的替代肝脏移植的解决方案。
图5 利用丝素蛋白在体外构建心脏微组织的策略
近年来，心脏组织疾病的治疗已成为再生医学中的一项重大挑战。研究表明，生物材料能够在实验室条件下诱导成纤维细胞转化为心肌细胞，但这些生物材料的效力取决于它们与外源性转录因子的相互作用。Hu等人的研究显示，仅使用基于丝素蛋白的生物材料就能够在体外条件下直接将静息的室性心肌细胞转化为类似窦房结心肌细胞的起搏心肌细胞，这一创新方法避免了外部转录因子或药物的需要，从而规避了免疫原性和不可控的分化问题，代表了一种有前景的基于蛋白质的体外心脏起搏模型。此外，3D生物打印技术的发展为精确制造具有时空几何结构的仿生三维动态模型（S3DMs）提供了可能，Mehrotra等人成功利用非桑蚕丝蛋白墨水打印出具有类似心脏组织的机械韧性的S3DMs，这可能有助于个性化的药物筛选工作。同时，研究者也在探索开发能够模拟肾脏等泌尿系统器官功能的体外模型，例如Szymkowiak等人使用丝素蛋白支架开发的体外肾脏模型，以及研究通过共培养管状细胞和源自ADPKD囊泡的细胞在3D胶原蛋白/丝素多孔支架中创建病理性肾脏模型，这些模型为药物筛选提供了新的平台和方法。
图6 基于SF的软骨类器官用于治疗OA
三维空间动态模型（S3DMs）在再生医学中展现出巨大潜力，特别是在处理软骨和骨组织同时受损的临床挑战方面。这些模型为干细胞在骨和软骨组织周围的募集提供了有利的微环境，并通过精细调控体内微环境（包括机械强度、孔径大小和骨基质组成）来增强成骨前体细胞的成骨分化效率。S3DMs不仅被用于研究骨折愈合过程和评估骨诱导能力，还被用于研究软骨细胞与干细胞之间的相互作用，促进软骨表型分化和软骨样细胞外基质的沉积。此外，S3DMs还被用于建立适合的骨关节炎（OA）疾病模型，加速临床治疗或筛选潜在的治疗干预措施。例如，通过光聚合和微流控技术结合开发的RGD-SF-DNA水凝胶微球（RSD-MS）在软骨再生和增强OA治疗策略方面展现出了希望。这些创新方法为软骨和骨组织的治疗提供了新的策略和工具。
图7 神经元样微组织的设计与功能表征
脑部是人体最为关键且复杂的组成部分之一，其特异性和复杂结构使其成为研究的焦点。由于缺乏通过解剖学分离的明确界限，对大脑功能单元的划分一直是一个挑战。三维空间动态模型（S3DMs）作为模拟神经组织结构复杂性、微环境因素、细胞间相互作用和细胞-细胞外基质动态的强有力工具，为理解大脑的复杂性提供了宝贵的见解。与传统的2D培养相比，3D类脑组织结构能够在时空条件下自我组织，更准确地代表大脑生理学中固有的复杂结构关系。S3DMs的多功能性在研究受损脑组织（如创伤性脑损伤和帕金森病的不同表型表达）中具有显著价值。S3DMs通过在相对有限的空间环境中共培养多种细胞类型，模拟体内组织的构造和组成。此外，与2D细胞培养系统相比，S3DMs因其多孔性质而展现出进行长期研究的潜力，为氧气和营养物质的运输提供了通道。未来的发展方向包括利用最先进的生物制造技术、人工智能（AI）和基因工程来构建具有增强复杂性和体内系统相似性的体外模型，尽管仍存在许多不确定性和障碍需要解决。例如，桑蚕丝基质缺乏依赖整合的细胞粘附序列，这限制了其促进早期细胞粘附的能力，但通过整合额外的整合素识别序列或化学共轭特定生长因子的修改可以增强细胞基质和SF之间的早期相互作用。
图8 支架对血管调节
血管化对于体外组织生长至关重要，但目前S3DM在实现复杂血管网络方面存在限制。传统的单层内皮细胞培养无法复制体内复杂的血管结构，而小血管的生成对于微循环系统的组织调节功能至关重要。研究正在探索使用3D丝素蛋白（silk fibroin, SF）支架和共培养技术来增强血管化，并模拟器官特异性的血管网络。通过3D共培养技术，可以利用细胞间的相互作用和信号分子的旁分泌来调节微环境，这对于模拟复杂的组织微环境具有潜力。尽管如此，体外模拟多细胞组织或包含多种细胞类型的挑战依然存在，这涉及到细胞分离、分化的复杂性和共培养技术的技术难度。
全文总结
三维干细胞分化模型（S3DM）是研究组织和器官生理学的重要工具。然而，当前的S3DM面临血管化和多细胞共培养的挑战。传统的单层内皮细胞培养无法复制体内复杂的血管网络，而小血管的生成对于微循环系统至关重要。此外，单一细胞类型的培养无法满足组织异质性的需求。通过使用3D丝素蛋白支架和共培养技术，可以促进血管化并模拟组织微环境，但实现多细胞组织的体外模拟仍然具有挑战性。
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