文：回溯档案

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黄瓜绿斑驳花叶病毒是黄瓜的重要病原，介导宿主-病原体相互作用的分子机制可能受到 microRNA的强烈影响，已知 microRNA 在疾病周期中调节基因表达。

本研究重点关注 14 个 miRNA及其靶基因，收集的数据用于构建与黄瓜-CGMMV相互作用相关的miRNA和靶基因的调控网络，该网络鉴定了与除csa-miRn7-5p之外的所有miRNA相关的608个潜在靶基因，通过靶基因相互关联，形成的子网络不显示与其他 miRNA 或其靶基因的任何连接性。

采用逆转录定量实时 PCR分析接种 CGMMV 后 42 天的黄瓜叶、茎和根样品种不同 miRNA 及其推定靶基因的表达水平，与其各自的靶基因之间存在正相关性，响应随时间点的不同的变化，证明这表明黄瓜 miRNA 与其靶基因之间的相互作用可能涉及其他因素，其中包括 miR159 和 csa-miRn6-3p 在内的多种 miRNA 与与植物对疾病的反应相关的靶基因相关。

RNA提取和cDNA合成

根据制造商的方案，使用 miRcute miRNA 分离试剂盒从叶、茎和根样品中提取 miRNA，根据制造商的说明，使用poly(A)加尾法和miRcute miRNA第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA，并保存在-20°C直至需要。

对于靶基因，根据制造商的方案，使用TRIzol试剂从叶、茎和根样品中提取总RNA，并使用NanoDrop 2000分光光度计评估其数量和质量，选择表现出1.8-2.0的A 260 /A 280比率和2.0-2.2的A 260 /A 230比率的RNA样品用于后续分析，使用带有 gDNA Eraser 的 PrimeScript RT Reagent 试剂盒合成 cDNA，并保存在 -20 °C 直至需要。

响应 CGMMV 感染的黄瓜 miRNA 的选择

2015 年，通过高通量测序鉴定出针对 CGMMV 感染进行差异调节的黄瓜 miRNA，88个miRNA的微阵列分析表明，CGMMV感染的黄瓜叶片中miR159、miR169、miR172、miR838、miR854、miR5658、csa-miRn6-3p、csa-miRn7-5p和csa-miRn8-3p的表达水平显着改变10、30 和 50 dpi 。

因此，在本研究中，14种miRNA，进一步分析其表达特征和在调控网络中的作用。

靶基因预测分析及调控网络构建

使用psRNATarget在线工具预测14个miRNA的靶基因，得分<4.0的目标被认为是潜在的目标基因，在植物中，miRNA/mRNA 互补区中心周围发生的错配往往会导致 miRNA 指导的 RNA 诱导沉默复合物 的裂解活性失效，mRNA与RISC的结合仍然可以在翻译水平上阻断基因表达，当小 RNA 序列的中央互补区域检测到不匹配时，psRNATarget 服务器会报告翻译抑制潜力。

然后使用基因本体论和京都基因和基因组百科全书分析结合 Uni-protKB 和国家生物技术信息中心 数据库来分配各种靶基因的功能，使用 Cytoscape 3.2.0 构建连接 miRNA 及其假定靶基因的调控网络 。

miRNA 及其假定靶基因的 RT-qPCR 分析

逆转录定量实时 PCR 用于研究黄瓜 miRNA 及其与植物防御反应相关的假定靶基因的表达水平，研究中使用的引物使用Primer Premier 5.0软件设计的，并由生工生物科技合成，使用黄瓜伸长因子 1-α 和泛素基因作为内参，对 RT-qPCR 数据进行标准化。

使用miRcute miRNA qPCR检测试剂盒进行miRNA的RT-qPCR。PCR 在 20 μL 反应混合物中进行，其中包含 10 μL 2 × miRcute miRNA Premix、1 μL cDNA、正向和反向引物各 0.4 μL以及 8.2 μL RNase -不含水，并使用 Applied Biosystems 7500 快速实时 PCR 系统按照以下程序进行处理：94°C 2 分钟，然后进行 40 个循环，94°C 20 秒，60°C 20 秒，34秒，反应终止后在 95 °C 生成熔解曲线。

6种miRNA和两个使用 RT-qPCR 和 SYBR 预混二聚体擦除系统研究了 csa-miRn6-3p 靶向的基因，使用 20 μL qPCR 反应混合物进行 PCR，其中包含 10 μL SYBR Premix Dimer Eraser (2 ×)、正向和反向引物各 0.6 μL (10 μM)、2 μL cDNA、0.4 μL ROX DyeII（ 50 ×）和 6.4 μL 无 RNase 水，使用以下程序：95 °C 30 s，然后进行 40 个循环：95 °C 5 s、55 °C 30 s 和 72 °C 34秒，反应终止后在 95 °C 生成熔解曲线。

每个 miRNA 或靶基因使用三个生物学重复，所有反应均进行三次，数据采用2- △△Ct法标准化：△△Ct=（Ct miRNA/靶基因-Ct EF-1α和泛素）感染-（Ct miRNA/靶基因- Ct EF-1α和泛素）对照。

响应 CGMMV 感染的黄瓜 miRNA 的选择

将未定位的序列与黄瓜基因组DNA进行比对，并根据miRNA筛选标准进行过滤，结果表明分离出12个新的miRNA，然而，对其前体的二级结构及其在茎环结构臂中的位置的分析表明，通过使用 RNAfold 软件的生物信息分析，这 12 个中只有 8 个被确认为新型 miRNA 。

靶基因预测及调控网络构建

psRNATarget 分析确定了与所评估的 13 个黄瓜 miRNA 相关的 608 个靶基因：397 个与 6 个 miRNA相关，211 个与 7 个 miRNA相关，但与第八个 csa-miRn7-5p 没有，然而，产生的调控网络表明单个靶基因可以受到多个 miRNA 的调控，五种 miRNA形成了一个复杂的调控网络，由 27 个受两个或多个 miRNA 影响的靶基因连接。

只有少数形成与 miR169、miR172、csa-miRn1-3p、csa-miRn2-3p、csa-miRn3-3p、csa-miRn4-5p 相关的更小的离散子网、csa-miRn5-5p 和 csa-miRn8-3p。

进行进一步分析，与已知的 miRNA miR159、miR169、miR172、miR838、miR854 和 miR5658 相关的那些被预测编码以下蛋白质：myb 相关蛋白 MYB29 样、假定的抗病蛋白 RGA3 样、乙烯响应转录因子 RAP2-7-分别是包含 MACPF 结构域的蛋白 CAD1 样、可能的 WRKY 转录因子 21 样和 LRR 受体样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 FLS2 样。

与新的 miRNA csa-miRn1-3p、csa-miRn5-5p 和 csa-miRn6-3p 相关的包括 UDP-糖基转移酶 73B3 样、葡聚糖内切 1,3-β-葡萄糖苷酶、发病机制相关同源域蛋白样、豌豆球蛋白样抗菌肽 2-1 样、乙烯反应性转录因子 CRF4 样、假定的抗病蛋白 RGA4 样、亚油酸 9S-脂氧合酶 1 样。

miRNA 经常通过短互补核苷酸序列的匹配来抑制其靶基因的表达，其中 miRNA 指导的 RNA 诱导沉默复合物会切割靶 mRNA，本研究中检查的所有 14 个 miRNA 均被发现含有与其靶基因相匹配的特征性互补序列，并且除了抑制翻译的 miR169 外，所有 miRNA 均被发现与 mRNA 切割相关，表明靶向降解是主要的机制。黄瓜中miRNA的调控模式。

CGMMV感染过程中黄瓜miRNA的差异表达

发现所有 14 种 miRNA 的表达水平在 CGMMV 感染的黄瓜植物中均发生显着改变，然而，表达模式极其复杂，并且根据组织类型和接种后时间点的不同而变化。例如，miR169、miR854和csa-miRn4-5p在叶组织中在1 dpi时显着上调，但在28 dpi时下调，而miR172、miR838、miR5658、csa-miRn6-3p和csa-miRn8-3p表现出相反的模式，在 1 dpi 时显着下调。

在黄瓜茎和根样本中，六种已知的 miRNA在 1 dpi 时下调，在黄瓜叶样品中，csa-miRn1-3p 在 35 dpi、csa-miRn2-3p 在 7 dpi、csa-miRn3-3p 在 7 dpi 和 csa-miRn5-5p 在 35 dpi 和 42 dpi 之间观察到显着上调，与其他 miRNA 相比，csa-miRn7-5p 和 csa-miRn8-3p 的表达水平始终较低。

CGMMV感染过程中靶基因的差异表达

与植物防御相关的八个靶基因的表达水平在 CGMMV 感染的样品中也发生了改变，并表现出类似的复杂表达模式，例如，Csa4M022940.1 和 Csa6M520360.1 在 1 dpi 的叶子样品中高度上调，而 Csa5M175970.1 在 35 dpi 的叶子和根样品中上调。

在感染后期叶样本中的 Csa1M470280.1 显着上调，而根样本中的 Csa4M045040.1 在 14 至 21 dpi 之间上调，miR169 靶标 Csa4M015840.1，此外，还注意到，叶和茎样品中 csa-miRn6-3p 靶标 Csa7M425940.1在 1 dpi 的表达水平显着高于其他时间点。

miRNA与靶基因表达的相关性

在整个感染期间，黄瓜叶样品中miR172的表达与其靶基因Csa5M175970.1呈正相关，然而，一般来说，miRNA的表达与其各自的靶基因之间的相关性根据时间点的不同而变化，表明其他因素可能参与其中调控这些靶基因并且miRNA-靶基因相互作用极其复杂。

miRNA 介导的调控的假设模型

调控网络、假定靶基因的功能分配和表达谱数据被用来构建一个假设模型，该模型说明了九种 miRNA与其靶基因相互作用，影响与黄瓜-CGMMV病理系统相关的生物过程，大多数 miRNA 影响单个过程，例如，miR172 和 csa-miRn1-3 分别与非生物和生物胁迫的反应相关。

在这种情况下，已知 miR172 的靶基因可以调节下游基因表达，以响应应激因子和应激信号转导途径的组成部分，csa-miRn1-3的靶基因被证实为尿苷二磷酸糖基转移酶，由H 2 O 2强烈诱导，这可能与活性氧和生长素信号传导相关的途径相互作用，并在糖基化激素和次级代谢产物介导的应激反应中发挥重要作用。

相比之下，miR159还通过两个靶基因在非生物和生物胁迫以及抗病性中发挥重要作用，其中一个是MYB转录因子，已知它是非生物胁迫耐受性和生物胁迫抗性的正调节因子，另一个是水杨酸结合蛋白，与抗病性有关。

Csa-miRn6-3p 还调节两个靶基因：促肾上腺皮质激素释放因子 (CRF) 和抗性基因类似物 (RGA)，这两个基因都与抗病性有关，另外两种 miRNA 也影响抗病性，miR169的靶基因被鉴定为RGA，可以触发限制病原体生长的防御系统。

此外，miR838靶向含有MACPF结构域的CAD1样蛋白，该蛋白负向控制超敏反应期间与程序性细胞死亡相关的SA介导的通路，miR854和miR5658的靶基因可能是WRKY转录因子21样蛋白和LRR受体样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶FLS2样蛋白，已知这两种蛋白在防御反应和抗病性中发挥重要作用。

植物-病原体相互作用， csa-miRn5-5p 的靶基因是一种葡聚糖内切 1,3-β-葡萄糖苷酶，它会触发响应真菌病原体的植物防御相关产物，该假设模型表明，多种miRNA和靶基因可以影响不同的代谢途径和细胞过程，其综合作用使黄瓜能够应对病毒感染相关的应激。

结语

植物 miRNA 最常见的是通过靶 mRNA 的转录后切割对其靶基因施加负调节，该过程由 RNA 诱导的沉默复合物催化，并由 miRNA 和靶基因中的互补序列介导例如，拟南芥叶片中 miR398 的下调会导致其 Cu/Zn 超氧化物歧化酶靶基因的上调，该基因参与对丁香假单胞菌的防御反应。

然而，也有报道称miRNA与其靶基因呈正相关，发现拟南芥根中 miR395 及其靶基因硫酸盐转运蛋白 的表达高度升高植物应对硫缺乏的反应，在大多数情况下，很难确定其他黄瓜 miRNA 与其各自靶基因之间的明确相关性，这再次表明一些其他因素可能会影响黄瓜 miRNA 与靶标的相互作用，并凸显了调控网络的复杂性，需要更多的研究来进一步表征黄瓜 miRNA 表达和调节的相互作用及其对下游生物过程的影响。

参考文献

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