AbMole精研抑制剂十年，最新的科研动态不断与您分享。本期与您分享的是:间充质干细胞通过JAK-STAT信号通路调节Th细胞保护自然衰老脓毒症模型大鼠的研究。
脓毒症是世界各地重症监护室患者，特别是老年患者死亡的主要原因。本研究采用自然衰老大鼠建立败血症模型，经尾静脉注射5×106脐带来源的MSCs。各组大鼠进行生存分析，生化指标检测，器官组织学染色，流式细胞术分析Th细胞亚群比和炎症细胞因子水平。Western blotting检测JAK-STAT信号通路的活性。我们设计了体外实验来证实MSCs的存在，并阐明了JAK/STAT抑制剂可能的作用机制。实验显示，MSCs治疗后脓毒症大鼠72 h生存率明显提高，脏器损伤和炎症浸润减少，脏器损伤指标水平降低，外周血和脾脏Th1/Th2、Th17/Treg比值明显降低，促炎细胞因子IL-6水平降低，抗炎细胞因子IL-10水平升高，STAT1和STAT3的磷酸化水平降低。这些结果在体外实验中得到了验证。因此，本研究证实MSCs可以通过调节Th细胞和炎症因子来控制脓毒症诱导的炎症反应，从而减少组织损伤，保护器官功能，最终提高老年脓毒症模型大鼠的生存期。抑制JAK-STAT信号通路可能是其作用的重要机制。
AZD1480(Abmole，M2044，纯度>98%)是一种新型，ATP竞争性的JAK2抑制剂，IC50为0.26 nM，选择性作用于JAK3和Tyk2，对JAK1的作用较弱。5μM AZD1480诱导细胞周期停在G2/M期，且通过抑制Aurora激酶而诱导细胞死亡。AZD1480是JAK2的有效抑制剂，作用于人类多发性骨髓瘤细胞，可以抑制生长，存活，FGFR3和STAT3信号，及下游靶点，包括Cyclin D2。在低微摩尔浓度时，AZD1480抑制细胞增殖和诱导骨髓瘤细胞系凋亡。
Fludarabine(Abmole，M2028，纯度为100%)是一种STAT1活性抑制剂和DNA合成抑制剂。Fludarabine有效抑制RPMI8226细胞增殖,呈时间浓度依赖性。Fludarabine处理MM.1S和MM.1R细胞48小时的IC50分别为13.48μg/mL和33.79μg/mL。而Fludarabine处理U266细胞48小时的IC 50为222.2μg/mL。Fludarabine在MM细胞中诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡。Fludarabine时间依赖性的诱导caspase，-8，- 9和- 3，- 7的剪切，继而诱导PARP的剪切。氟达拉滨以时间梯度增加Bax基因表达，而Bak基因表达量不变。Fludarabine诱导显著降低STAT - 1磷酸化，但不改变JAK 2活性。Fludarabine（1.5mg）在处理2天后和7天后显著降低磷酸化STAT - 1和STAT-1总蛋白量。Fludarabine可在免疫缺陷小鼠中有效抑制RPMI 8226细胞的骨髓转移。
Cryptotanshinone(Abmole，M3982，纯度>98%)是一种从丹参的根中提取的天然化合物，抑制STAT3的IC50为4.6 μM，具有潜在的抗肿瘤活性。
FIGURE 7. Levels of inflammatory factors in cell supernatants and the proportion of Th cells in lymphocytes and the expression levels of STAT1 and STAT3 in each group after the use of inhibitors.
该图为使用抑制剂后各组细胞上清中炎症因子水平、淋巴细胞中Th细胞比例及STAT1、STAT3表达水平。从大鼠脾脏分离的淋巴细胞与MSCs按10:1的比例共培养，使用抑制剂共培养24h。实验中使用的抑制剂浓度为AZD1480 (5mM)、Fludarabine(100mM)和Cryptotanshinone(50mM)。图A-F是使用JAK抑制剂后各实验组Th1、Th2、Th17、Treg细胞在CD4+ T细胞中的比例及Th1/Th2、Th17/Treg的比值(n=5);图G是使用JAK抑制剂后各实验组上清液中IFN-γ水平(n=5);图H是使用JAK抑制剂后各实验组上清液中IL-17A水平(n=5);图I-K是使用STAT1抑制剂后各实验组CD4+ T细胞中Th1、Th2细胞比例及Th1/Th2比值(n=5); (L)使用STAT1抑制剂后各实验组细胞上清中IFN-γ水平(n=5);图M, N是各实验组淋巴细胞中STAT1和p-STAT1的表达水平及半定量分析结果(N =3);图O-Q是使用STAT3抑制剂后各实验组Th17、Treg细胞占CD4+ T细胞的比例及Th17/Treg比值(n=5); (R)使用STAT3抑制剂后各实验组细胞上清中IL-17A水平(n=5)。
与LPS刺激的样品相比，JAK抑制剂(AZD1480)的作用导致淋巴细胞中Th1和Th17的比例明显降低，Th1/Th2和Th17/Treg的比例也明显降低。IFN-γ(Th1-特异性细胞因子)和IL-17A (Th17特异性细胞因子)抑菌剂处理的细胞上液也减少。此外，加入JAK抑制剂后，MSCs共培养组的Th1、Th17比值及其特异性细胞因子水平较抑制剂处理组降低，差异有统计学意义(图7A-H)。服用STAT1抑制剂后，淋巴细胞中Th1细胞的比例和IFN-γ水平明显降低，与共培养组的变化一致。STAT1抑制剂会降低淋巴细胞中STAT1的水平，p-STAT1的水平明显低于LPS刺激的细胞(图7I-N)。同样，使用STAT3抑制剂后，淋巴细胞中Th17的比例和IL-17A的水平明显降低，这与共培养组的变化一致，添加抑制剂后淋巴细胞中STAT3水平降低，p-STAT1水平明显低于LPS刺激细胞(图7O-T)。
鸣谢：Lu Wang, et al. Front Immunol. 2022 Feb 7;13:820685.
